植物生長調節劑對草石蠶愈傷組織和不定芽誘導的影響

(貴州大學農學院， 貴陽 550025)

草石蠶(StachyssiebordiiMiq.)屬唇形科水蘇屬植物[1]，是我國的特色蔬菜之一[2]，江蘇、重慶、甘肅、貴州等省區均有種植[3]。草石蠶為我國創匯蔬菜，含有豐富的水蘇糖[4]，并富含蛋白質、氨基酸和維生素等營養物質；經鹽漬、醬制加工后風味獨特，為佐餐之佳品[5]；在保健食品和藥用開發利用方面前景十分廣闊[6-7]。

草石蠶為無性繁殖[8]，在長期的無性繁殖過程中，易感染多種病毒，造成種性退化。組織培養不僅可以解決以上問題，而且還可以提純復壯[9]。遵義務川草石蠶為貴州優質品種，但在長期栽培中存在種性退化問題，嚴重影響當地草石蠶產業的發展。草石蠶組培快繁方面的研究較少，且研究不夠深入[10-12]。為系統研究其組培快繁技術，針對草石蠶愈傷組織誘導和不定芽分化進行了研究，旨在加快繁殖速度，提高繁殖率，為加速草石蠶優良種質繁育和推廣步伐奠定基礎，對進一步研究草石蠶脫毒苗的快繁有重要的理論和實踐意義。

表1 植物生長調節劑對莖段愈傷組織誘導的影響

序號NAA/(mg·L-1)6-BA/(mg·L-1)GA3/(mg·L-1)愈傷誘導率/ % 鮮重/g 干重/g 愈傷顏色、質地長勢10.00.00.00.00Ef0.000Jj0.0000Fg無無20.02.00.516.25De0.049GHIefg0.0175BCDcd淺綠色顆粒++30.04.01.510.00De0.051GHIfg0.0171BCDcd褐色質密+40.06.02.515.00De0.063FGHIefg0.0072DEdef綠色質密+50.20.00.51.25De0.021HIgi0.0020Ef褐色質密+60.22.00.066.25BCbcd0.071EFGHdef0.0178BCDcd綠色顆粒++70.24.02.571.25BCcd0.104CDEcd0.0183ABCbc綠色顆粒++80.26.01.562.50Cd0.084EFGde0.0144CDEde褐色顆粒++90.40.01.50.75De0.046GHIgi0.0078DEef褐色質密+100.42.02.583.75ABCabc0.086EFGcd0.0138CDEde淺綠色顆粒++110.44.00.091.25ABab0.139ABCb0.0208ABab淺綠色質密++120.46.00.577.50BCbc0.159Aa0.0252Aab褐色顆粒+130.60.02.56.25De0.012Hi0.0064DEef褐色質密+140.62.01.588.75ABabc0.125BCDbc0.0201ABab淺綠色質密+150.64.00.588.75ABabc0.147ABb0.0267Aab綠色質密++160.66.00.096.25Aa0.153Aa0.0270Aa淺綠色顆粒+++

注：表中同列不同大寫字母表示p<0.05；不同小寫字母表示p<0.01。下同。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗材料為貴州省務川仡佬族苗族自治縣主栽草石蠶品種。

1.2 方 法

1.2.1愈傷組織誘導

選擇長勢良好幼嫩的草石蠶葉片和莖段，用75%乙醇浸泡2 s，再用1% NaClO溶液消毒10 min，用無菌水漂洗3～4次。將已滅菌的葉片(切成1 cm × 1 cm方塊)和莖段(約0.8 cm)接種到不含激素的MS培養基上，暗培養4 d后接種到MS + NAA 0、0.2、0.4、0.6 mg·L-1+ 6-BA 0、2、4、6 mg·L-1+ GA30、0.5、1.5、2.5 mg·L-1的培養基上，進行三因素四水平 L16(43)的正交試驗設計，研究培養基中6-BA、NAA和GA3對愈傷組織誘導的影響。每個處理接種80個外植體，3次重復。在(25±1)℃，3 000 lx，光照14 h·d-1的條件下培養40 d后，統計愈傷組織誘導率及生長狀況。

1.2.2不定芽誘導

稱取長勢良好一致的0.3 g愈傷組織接種到MS+NAA 0.1、0.3、0.5、0.7 mg·L-1+ 6-BA 0、2、4、6 mg·L-1+ GA30、1、2、3 mg·L-1的培養基上，進行三因素四水平 L16(43)的正交試驗設計，研究培養基中6-BA、NAA和GA3對不定芽誘導的影響。每處理培養30個愈傷，3次重復。在(25±1)℃，3 000 lx，光照14 h·d-1的條件下培養40 d后，觀察并統計不定芽誘導情況。

1.3 數據處理與分析

試驗調查統計愈傷組織誘導率、愈傷組織干鮮重、不定芽誘導率及芽長等。

愈傷組織誘導率(%)=(形成的愈傷組織數/接種的外植體數)×100%。

不定芽誘導率(%)=(誘導出的不定芽數/接種的愈傷組織數)×100%。

采用DPS(7.05)軟件對數據進行處理分析，LSD方法進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 植物生長調節劑對愈傷組織誘導的影響

2.1.1草石蠶莖段愈傷組織的誘導

當6-BA、NAA、GA3均為0時，未誘導出愈傷組織(表1)。當6-BA濃度為0時，各處理的相關指標與其他處理(6-BA濃度為2、4、6 mg·L-1)相比差別最大，說明6-BA對愈傷組織誘導的影響較大。處理16誘導的愈傷組織誘導率最大，為96.25%，處理11、14、15、10和處理12的愈傷組織誘導率分別為91.25%、88.75%、88.75%、83.75%和77.50%，處理16的愈傷組織誘導率與處理12達極顯著差異水平。由以上可知，處理16的莖段愈傷組織誘導效果最好；處理12的愈傷組織鮮重最大，為0.159 g；處理16次之，為0.153 g，但兩者之間未達到顯著性差異水平；處理15和處理11的愈傷組織鮮重分別為0.147 g和0.139 g，并與處理12之間達到顯著性差異水平。處理16的愈傷組織干重最大，為0.027 0 g；處理15、12和處理11的愈傷組織干重分別為0.026 7 g、0.025 2 g和0.020 8 g，它們與處理16之間均未達到顯著性差異。處理12的愈傷組織為褐色顆粒，而處理16的愈傷組織為淺綠色顆粒，并且處理16的愈傷組織長勢最好。綜合考慮，處理16(MS + NAA 0.6 mg·L-1+ 6-BA 6.0 mg·L-1)為莖段愈傷組織誘導的最佳培養基。

表2 植物生長調節劑對葉片愈傷組織誘導的影響

序號NAA/(mg·L-1)6-BA/(mg·L-1)GA3/(mg·L-1)愈傷誘導率/%鮮重/g 干重/g 愈傷顏色、質地長勢10.000.00.00Fk0.000Ff0.000Fg無無20.020.575.00ABCabcd0.124DEde 0.025DEef淺綠色顆粒+++30.041.555.00BCDcdef0.173DEde0.037DEdef淺綠色顆粒++40.062.543.75CDEef0.077Ede 0.015DEef淺綠色顆粒++50.200.531.25DEfg0.044Ee0.012Eef 淺綠色顆粒++60.220.092.50Aab0.508ABab0.058CDEde褐色顆粒++70.242.551.25BCDdef0.145DEde0.025DEef 淺綠色顆粒+80.261.576.25ABab0.354BCDbc0.069BCDcd褐色顆粒+90.401.513.75Eg0.094DEde 0.003Ef 淺綠色顆粒+100.422.555.00BCDcdef0.246CDEcd0.052CDEde淺綠色顆粒++110.440.068.75ABCbcd0.523ABab0.109ABab褐色質密+120.460.590.00Aab0.440ABCb0.093ABCcd淺綠色顆粒++130.602.513.75Eg0.021Ee0.004Ef 淺黃色顆粒+140.621.566.25ABCbcd0.210DEde0.068BCDcd黑色顆粒+150.640.591.25Aab0.498ABab0.109ABab淺綠色質密+++160.660.097.50Aa0.647Aa0.132Aa淺綠色顆粒+++

2.1.2草石蠶葉片愈傷組織的誘導

由表2可知，以葉片為外植體，當6-BA、NAA、GA3均為0時，無愈傷組織被誘導出。當6-BA濃度為0時，各處理的相關指標與其他處理(6-BA濃度為2、4、6 mg·L-1)相比差別最大，說明6-BA對愈傷組織誘導的影響較大。處理16的愈傷組織誘導率最高，達97.50%，除處理15、6、12、8和處理2外，與其它處理之間均達到了顯著性差異水平。處理16的鮮重和干重均最大，分別為0.647 g和0.132 g，處理11的鮮重和干重次之，處理16與處理11之間的鮮、干重差異不顯著。愈傷組織顏色、質地較好的分別為處理2、3、4、5、7、9、10、12、16。愈傷組織長勢良好的是處理2、15、16。綜上所述，處理16為葉片愈傷組織誘導的最佳植物生長調節劑配比組合。

2.2 植物生長調節劑對不定芽分化的影響

不定芽分化是組織培養的關鍵步驟之一。當6-BA濃度為0時，愈傷組織不能被誘導出芽，說明6-BA在不定芽誘導中起著決定性作用(表3)；隨著6-BA濃度的增高，不定芽誘導率升高。本試驗不定芽誘導率最高的為處理4，誘導率達76.67%；其次為處理3，誘導率為53.33%，并與處理4之間達到極顯著差異水平。在一定濃度范圍內，隨著NAA濃度的增加，不定芽的誘導率呈降低趨勢；說明高濃度的6-BA和低濃度的NAA培養基配方有利于草石蠶不定芽的誘導，以處理4為最佳。

由表3可知，處理3分化不定芽數最多，為13.25個，其次為處理4，為11.91個，兩處理間未達到顯著性差異水平。不定芽長勢最好的是處理2和處理4，其次是處理3。處理11的株高最大，為4.00 cm，但長勢較弱，處理4的株高雖然不高，但長勢最好，明顯優于處理11。綜合考慮，處理4(MS + NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 6 mg·L-1+ GA33 mg·L-1)為草石蠶不定芽誘導的最佳培養基。

3 討 論

3.1 植物生長調節劑對愈傷組織誘導的影響

草石蠶愈傷組織的高效誘導是草石蠶組織培養過程中的一個重要環節，為基因工程等研究提供技術支撐，同時，也為提取、分離其中保健及藥理有效成分提供了材料。王莉以美國“草原”薄荷為材料，研究其愈傷組織中揮發油成份，認為外源類激素物質是愈傷組織誘導的重要因素[13]。張春梅等對銀斑百里香研究得出，MS + NAA 0.15 mg·L-1+ 6-BA 0.6 mg·L-1是最佳的愈傷誘導培養基[14]。蔡漢權研究認為，羅勒的最佳愈傷誘導培養基是MS + NAA 0.1 mg·L-1+ 6-BA 4.0 mg·L-1[15]。張東向等研究發現，黃芩的最佳愈傷組織誘導培養基為MS + NAA0.2 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1[16]。本試驗研究結果顯示，草石蠶莖段和葉片愈傷組織誘導的最佳培養基為MS + NAA 0.6 mg·L-1+ 6-BA 6 mg·L-1。王貽蓮等研究得出，NAA是影響薄荷誘導愈傷的重要因素，在濃度為0.2 mg·L-1時，愈傷誘導率達92%以上[17]。許真研究認為，BA 對藠頭愈傷組織的形成具有促進作用，濃度越高形成愈傷組織越多[18]。隨著6-BA濃度的增加，枸杞花藥愈傷組織誘導率越高，以MS+2,4-D 1.0 mg·L-1+6-BA 2.0 mg·L-1最佳[19]。本試驗研究發現，6-BA對草石蠶愈傷組織誘導的影響最大，當濃度為0時，愈傷組織誘導較低，并且長勢不好；當6-BA濃度為6 mg·L-1時，其愈傷組織誘導率最高，長勢也最佳。這與許真[18]和段麗君[19]的研究結果一致，但與王貽蓮等[17]的研究結果不同，這可能與試驗材料不同有關。

表3 植物生長調節劑對不定芽誘導的影響

處理NAA/(mg·L-1)6-BA/(mg·L-1)GA3/(mg·L-1)接種數/個誘導數/個誘導率/%芽數/個株高/cm長勢10.1003000.00Ee0.00Bd0.00Dd無 20.12130930.00Cc6.56Abc1.44BCb+++30.142301653.33Bb13.25Aa1.51Bb++40.163302376.67Aa11.91Aab0.60Cc+++50.3013000.00Ee0.00Bd0.00Dd無 60.32030413.33CDcd8.75Aabc1.03BCb+70.34330826.67CDcd3.75Ac1.73Bb+80.362301240.00Cc4.50Ac1.48Bb+90.5023000.00Ee0.00Bd0.00Dd無 100.52330516.67CDcd6.00Abc2.30Bb+110.5403013.33Dd3.00Ac4.00Aa+120.56130310.00CDcd7.00Abc2.10Bb+130.7033000.00Ee0.00Bd0.00Dd無 140.7223026.67Dd5.50Ac1.50Bb+150.74130310.00CDcd4.50Ac0.95BCb+160.7603013.33Dd4.50Ac1.85Bb+

3.2 植物生長調劑對不定芽的誘導的影響

愈傷組織誘導不定芽是脫分化細胞進行再分化的過程，其成功的關鍵因素是生長素和細胞分裂素的濃度配比。不同激素種類在不同植物上使用時存在很大差異[20-22]。一般情況下，誘導不定芽時，細胞分裂素要比生長素濃度高。中等濃度(1.0～2.0 mg·L-1)的細胞分裂素(BA、KT、ZT和TDZ)與低濃度(0.1～1.0 mg·L-1)的NAA配合均能促使魔芋Ⅲ型(淺紅或綠色，呈瘤狀或球狀，結構致密)愈傷組織再生植株[23]。陳丹萍等[12]以草石蠶莖尖、莖段組織為外植體直接誘導不定芽，得出MS+6-BA 7.0 mg·L-1+ NAA 0.5 mg·L-1為最佳培養基，莖尖和莖段的不定芽誘導率分別達39.2%和33.3%。本試驗經愈傷組織間接再生途徑誘導不定芽時，得出MS + NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 6 mg·L-1+ GA33 mg·L-1培養基的效果最佳，不定芽誘導率為76.67%，大大提高了不定芽誘導率。

在辣椒材料上，誘導不定芽的6-BA最佳濃度為 5 mg·L-1，濃度太低，不定芽誘導率不高，而濃度大于 6 mg·L-1時，雖然不定芽能被大量誘導，但質量差，大部分為畸形，繼續培養芽難以伸長[24-26]。張煒坤等研究認為，隨6-BA濃度升高(1～3 mg·L-1)，北蒼術不定芽誘導率呈先升高后降低的趨勢，但6-BA濃度不能過高，當達到3 mg·L-1時，不定芽的葉片卷曲，幼苗出現玻璃化和畸形現象[27]。本研究得出，草石蠶不定芽誘導的最佳培養基為MS + NAA 0.1 mg·L-1+6-BA 6 mg·L-1+ GA33 mg·L-1，不定芽誘導率為76.67%，并且芽長勢最好，這與前人研究的結果不一致，這主要是因為不同試驗材料對6-BA的忍耐程度有關。林碧英等對生姜的研究表明，在NAA濃度不變的情況下，隨著6-BA濃度的增加，生姜生長點成芽率下降[28]。但本研究認為，NAA濃度低時(0.1 mg·L-1和0.3 mg·L-1)，隨著6-BA濃度的增加，草石蠶不定芽誘導率逐漸增加，這與林碧英等研究的結果相反，這主要是與試驗材料和生長調節劑濃度不同有關。