距瓣豆對鹽脅迫的生理響應及綜合評價

(中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所/農業部華南作物基因資源與種質 創制重點實驗室， 海南 儋州 571737)

距瓣豆(Centrosemapubescens) 又稱蝴蝶豆或毛蝶豆，屬蝶形花科，是一種適用于熱帶地區產量高、抗逆性強、適口性好的優良熱帶豆科牧草[1]，常被作為綠肥廣泛用于橡膠園、果園等。據報道，在云南，距瓣豆作為綠肥在開割膠園中，有機碳含量增多[2]，酸性磷酸酶活性增強[3]，促進土壤中磷的循環[4]，說明距瓣豆覆蓋膠園后適應性強，開發價值高[5-6]，對土壤肥力有一定的提升和維持作用[7]。在甘蔗園中套種距瓣豆,不僅可以改善飼草的營養價值，而且可以提高單位面積的飼草產量和質量[8]。

表1 20份距瓣豆種質明細

材料編號品系名采集地經度緯度海拔1CIAT25118CIAT引入2CIAT5627CIAT引入3050321040海南五指山10930.9601847.948363.004CIAT873CIAT引入5050320026海南保亭什嶺鎮10951.1741839.23372.606020401049海南萬寧長豐11012.00022601.03518.507CIAT5631CIAT引入8071103014海南儋州10930.0641930.934119.609020301004海南三亞10944.0791926.93012.2010060219004海南昌江10901.0191915.56851.7011050321038海南保亭10938.1951827.214111.2012050320020海南陵水11000.1811834.12635.0013050320027海南保亭10951.1741839.23372.6014060219003海南昌江10901.0191917.98451.7015CIAT5189CIAT引入16050320021海南陵水提蒙11000.1811834.12635.0017050321057海南白沙10929.7281909.102190.1018071029001海南樂東10912.7501842.256204.8019050319008海南昌江大坡10901.6401917.984112.8020南02139南繁基地引入

注：CIAT為哥倫比亞國際熱帶農業中心。

我國鹽漬化土地面積隨著環境惡化及不合理開發，已超過可耕地總面積的25%，并還在增加[9]。因此，如何改良和開發利用鹽漬化土地，已經成為當前必須解決的大事[10-11]。研究表明，利用植物改良鹽堿化土地是最經濟、最有效的措施之一[12-14]。

目前，對于蝴蝶豆的研究集中在施肥[15-18]、產量[19-20]、耐蔭性[21]、抗旱性[22]及發芽方法[23]等方面，耐鹽性方面的研究還未見報道，而蝴蝶豆作為重要的熱帶亞熱帶豆科牧草，研究其耐鹽性的生理變化，弄清其耐鹽機理，對選育優良的品種和提高牧草的產量具有十分重要的意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

距瓣豆種質材料共20份(見表1)，由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所牧草中心提供。

1.2 試驗設計

試驗于2014年7月在中國熱帶農業科學院品種資源作物研究所牧草中心溫室大棚中進行，室內平均最高溫度(31.8±3)℃，平均最低溫度(21.0±3)℃，平均相對濕度(60±5)%，采用苗期鹽境脅迫法。為了確定距瓣豆品系苗期耐鹽性篩選的適宜鹽濃度，用CIAT 25118、050321040、020401049、060219004、071029001等5份種質為材料，分別采用4、6、8、10、12、14 g·L-1鹽濃度進行預試驗。通過葉綠素及植株生長情況，發現植株在10 g·L-1鹽濃度脅迫下，品系間各生長指標差異顯著，因而將10 g·L-1鹽濃度定為距瓣豆屬種質苗期耐鹽性鑒定的適宜鹽濃度，以蒸餾水為對照，3次重復。在花盆中(內口徑21 cm，高25 cm，每盆裝入5.5 kg表土)育苗，保證每盆4～5株長勢一致的苗，2個月后待苗生長至30 cm時，按10 g·L-1NaCl進行鹽脅迫處理，每處理3次重復，處理第15天分別測定葉綠素(SPAD)、質膜透性(relative electrical conductivity rate，REC)、游離脯氨酸含量(free praline contents，Pro)、丙二醛含量(malondialdehyde，MDA)、葉片相對含水量(relative water content，RWC)。

1.3 指標測定

測定指標均參照《植物生理學實驗指導》[24]，葉綠素含量(Chl)用葉綠素儀對距瓣豆由上至下第5片葉子進行直接測定；質膜透性的測定采用電導儀法；游離脯氨酸(Pro)含量的測定采用酸性茚三酮法；丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸法。

1.4 距瓣豆種質材料苗期耐鹽性綜合評價

1) 為了減小試驗材料間本身的差異，使用各指標的相對值來表示，耐鹽性常用耐鹽指數(salt tolerance trait index，STTI)表示。

表2 不同處理時間和不同濃度下的葉綠素相對值的變化 單位：%

材料編號 8d 15d 4g·L-18g·L-112g·L-14g·L-18g·L-112g·L-1CIAT25118135.11a127.59ab134.91a142.96a85.65—CIAT5627126.16ab144.41a130.58ab120.15ab104.93—05032104092.70abc88.95ab100.14abc90.13ab90.23—CIAT87383.04bc97.14ab81.2bc74.39b——05032002689.28abc101.10ab84.96abc89.34ab81.86—02040104992.67abc84.91b92.77abc91.55ab74.30—CIAT563188.02abc88.21b83.43abc73.80b76.68—07110301491.22abc97.63ab90.40abc79.89b79.30—02030100475.85c73.67b75.88c73.73b68.25—060219004102.03abc100.41ab98.72abc103.18ab93.88—05032103893.38abc90.78ab78.67bc73.77b78.28—05032002099.73abc102.51ab84.56abc83.95ab72.59—050320027117.92abc112.04ab107.65abc122.12ab126.08—060219003116.17abc106.26ab106.31abc74.25b82.55—CIaT5189118.81abc107.58ab106.06abc104.71ab99.70—050320021118.33abc104.22ab91.26abc87.14ab103.71—050321057109.79abc103.14ab96.82abc———07102900197.59abc95.07ab93.91abc79.14b68.27—050319008108.42abc102.42ab84.72abc93.84ab80.58—南0213999.87abc94.19ab85.42abc81.75b93.47—平均值102.80101.1195.4291.5786.68—標準誤15.5015.1015.7519.3214.93—顯著性****ns—

注：表中小寫字母表示(p<0.05)差異顯著，ns表示差異不顯著。下同。

STTI=(處理指標值/對照指標值)×100%。

2) 隸屬函數分析距瓣豆種質參試材料利用下列隸屬函數公式(1)、(2)求得：

i=4,8,12，j=1,2,,n

(1)

i=4.8,12，j=1,2,,n

(2)

判斷各項指標是正相關還是負相關，如果是正相關則用公式(1)計算，如果是負相關則用公式(2)計算。

式中，i表示濃度為i的第j個綜合指標值；Xi(min)表示濃度i綜合指標當中的最小值；Xi(max)表示濃度i綜合指標當中的最大值。

3) 聚類分析用SAS 9.1軟件進行方差分析，利用Excel軟件進行隸屬函數計算,以及用SPSS 18.0進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫對距瓣豆生理指標的影響

2.1.1鹽脅迫對距瓣豆葉綠素含量的影響

由表2可以看出，距瓣豆的葉綠素含量隨著濃度的增大呈下降趨勢，但也會因為試驗環境嚴謹性不高而有波動。在鹽脅迫第8天時，不同濃度鹽處理的距瓣豆屬種質間的葉綠素相對值差異顯著，其中鹽濃度為4 g·L-1，有9份距瓣豆種質的相對葉綠素值大于100%，CIAT 25118的葉綠素值最高，達135.11%，顯著高于CIAT 873、020301004距瓣豆；鹽濃度8 g·L-1，有11份距瓣豆種質的葉綠素值高于對照，CIAT 5627的葉綠素值最高，達144.41%，顯著高于020401049、CIAT 5631、020301004距瓣豆；鹽濃度12 g·L-1時，有6份距瓣豆種質的葉綠素值高于對照，CIAT 25118的葉綠素值最高，達134.91%，顯著高于CIAT 873、020301004、050321038距瓣豆。

當鹽脅迫至15 d時，鹽濃度為4 g·L-1時，050321057距瓣豆死亡，5份距瓣豆種質的相對葉綠素值大于100%；鹽濃度為8 g·L-1時，CIAT 873、050321057距瓣豆死亡，3份距瓣豆種質的相對葉綠素值大于100%；鹽濃度為12 g·L-1時，20份距瓣豆全部死亡。

2.1.2鹽脅迫對距瓣豆質膜透性的影響

由表3可知，在鹽脅迫處理第8天時，當鹽濃度4 g·L-1時，20份距瓣豆種質間的相對質膜透性差異不顯著，有8份距瓣豆的相對質膜透性值大于100%，其中CIAT 873距瓣豆的相對質膜透性值最大，達115.85%；當鹽濃度8 g·L-1時，20份距瓣豆種質間的相對質膜透性差異達極顯著，其中60219003距瓣豆的相對質膜透性值最大(134.23%)，極顯著高于050321038、050320027、CIAT 5189、050320021、071029001距瓣豆；當鹽濃度達到12 g·L-1時，相對質膜透性差異不顯著，有10份距瓣豆種質的相對質膜透性大于100%，其中60219003距瓣豆的相對質膜透性值最大(140.61%)。

表3 不同處理時間和不同濃度下的質膜透性相對值的變化

材料編號 8d 15d 4g·L-18g·L-112g·L-14g·L-18g·L-112g·L-1CIAT25118111.2497.40ab107.64112.81ab124.36—CIaT5627102.9487.83ab98.1468.40b91.28—050321040109.2898.45ab107.38102.85ab140.43—CIaT873115.85112.60ab111.61120.60ab——050320026103.92106.06ab99.9687.71ab108.06—02040104996.96101.15ab119.1790.35ab138.37—CIaT5631111.98111.75ab126.85127.54ab145.18—07110301495.81115.41ab124.7884.20ab117.18—02030100490.7296.59ab85.7087.41ab120.09—06021900494.7285.54ab90.6978.79ab97.68—05032103894.8077.39b99.8388.84ab111.97—05032002088.0798.06ab76.7578.50ab98.59—05032002777.6777.09b104.4765.49b91.05—060219003106.47134.23a140.61139.15a91.34—CIaT518987.3081.64b96.4975.24ab115.44—05032002191.5280.81b80.9378.31ab99.99—05032105799.4696.40ab96.98———07102900184.4377.05b97.8786.58ab122.15—05031900899.2891.18ab116.10103.82ab113.96—南02139105.9996.20ab128.4793.07ab118.94—平均值98.4296.14105.5293.14113.67—標準誤10.1214.8716.7120.0016.81—顯著性ns*ns*ns—

在處理第15天時，20份距瓣豆種質材料的相對質膜透性隨著鹽濃度的升高而升高。其中鹽濃度為4 g·L-1時，相對質膜透性值最大的是060219003(139.15%)，鹽濃度為8 g·L-1時，相對質膜透性值最大的是CIAT 5631(145.18%)，當鹽濃度達12 g·L-1時，20份距瓣豆種質均無存活。

2.1.3鹽脅迫對距瓣豆脯氨酸含量的影響

由表4可看出，不同鹽脅迫處理時間及濃度對距瓣豆種質間的相對脯氨酸含量差異均不顯著。鹽脅迫處理第8天時，從相對游離脯氨酸含量的平均值看，鹽濃度為4 g·L-1與8 g·L-1時差異很小，二者僅相差0.37%。當鹽濃度達到12 g·L-1時，相對游離脯氨酸含量急劇上升，較濃度為4 g·L-1時增長16.84%，較濃度為8 g·L-1時增長17.48%。

鹽脅迫處理第15天時，鹽濃度為4 g·L-1時的相對游離脯氨酸平均值與8 g·L-1時差異很小，二者僅相差0.49%；當鹽濃度為12 g·L-1時，20份距瓣豆種質均死亡。

2.1.4鹽脅迫對距瓣豆丙二醛含量的影響

由表5可知，不同鹽脅迫處理時間及濃度對距瓣豆種質間的相對丙二醛含量差異均達極顯著。脅迫處理第8天，鹽濃度為4 g·L-1時，20301004距瓣豆的相對丙二醛含量極顯著高于071103014距瓣豆，差異達8.77倍；鹽濃度為8 g·L-1時，南02139距瓣豆的相對丙二醛含量最大，達336.70%，極顯著高于除050320027、060219003距瓣豆外的剩余17份距瓣豆種質；鹽濃度為12 g·L-1時，南02139距瓣豆的相對丙二醛含量最大，達441.70%，極顯著高于除050321040、050320027距瓣豆外的剩余17份距瓣豆種質。

脅迫處理到第15天，鹽濃度為4 g·L-1時，南02139距瓣豆的相對丙二醛含量極顯著高于剩余的19份距瓣豆，達125.18%；鹽濃度為8 g·L-1時，050320027距瓣豆的相對丙二醛含量最大，達217.60%，極顯著高于除050321040、050321038、南02139距瓣豆的剩余16份距瓣豆種質，鹽濃度為12 g·L-1時，苗已處理致死。

表4 不同處理時間和不同濃度下的游離脯氨酸含量相對值的變化 單位：%

材料編號 8d 15d 4g·L-18g·L-112g·L-14g·L-18g·L-112g·L-1CIAT2511868.9867.2569.0668.7867.68—CIAT562768.9366.7171.2967.9467.84—05032104069.5667.9393.9978.1479.07—CIAT87368.2667.0075.2178.09——05032002667.8367.3673.2367.7568.55—02040104967.2468.5181.0573.1171.24—CIAT563168.6365.4671.4266.1265.75—07110301466.9067.04122.3566.9366.61—02030100468.0067.2577.1374.9061.03—06021900467.7467.2766.8267.5968.29—05032103867.2168.7868.4268.7975.22—05032002067.1367.1168.0670.8570.29—05032002768.4666.7571.0367.9854.39—06021900367.4770.6184.5456.2282.33—CIAT518966.0165.3972.9666.7077.97—05032002166.9167.7076.6567.3879.12—05032105768.4168.1590.11———07102900167.5766.9777.3971.9451.41—05031900867.7967.72103.9773.5685.05—南0213967.4968.2370.2868.4371.42—平均值67.8367.4679.2569.6970.18—標準誤3.216.859.162.987.75—顯著性nsnsnsnsns—

表5 不同處理時間和不同濃度下的丙二醛含量相對值的變化

材料編號 8d 15d 4g·L-18g·L-112g·L-14g·L-18g·L-112g·L-1CIAT25118104.20ab63.90b152.60b140.83b126.70b—CIaT562792.80ab100.80b76.40b91.64b135.60b—050321040157.60ab83.80b316.50ab137.23b184.38ab—CIaT87388.10ab80.70b158.10b94.06b——05032002693.00ab89.20b100.70b55.77b86.90b—020401049117.30ab80.90b116.80b87.79b74.60b—CIaT563195.90ab95.60b151.40b65.71b91.20b—07110301461.50b55.20b83.00b35.84b50.10c—020301004539.40a73.30b93.30b32.77b73.60b—060219004114.70ab109.60b225.40b93.38b97.60b—050321038118.80ab25.60b159.90b110.02b167.40ab—05032002089.90ab55.70b85.10b42.75b87.70b—050320027233.80ab227.50ab309.00ab118.91b217.60a—06021900384.40ab278.40ab112.40b89.32b146.40b—CIaT5189104.80ab79.80b139.80b74.42b75.30b—05032002178.80ab41.60b125.30b80.32b128.30b—050321057108.00ab76.20b191.70b-——071029001133.90ab99.20b148.00b55.31b94.71b—050319008117.50ab44.40b106.10b63.01b108.47b—南02139172.40ab336.70a441.70a125.18a204.60ab—平均值135.34104.91164.6683.91119.51—標準誤20.8910.5631.4514.659.97—顯著性*****—

表6 各指標在濃度為8 g·L-1時的隸屬函數值對比分析和綜合評價

編號材料 隸屬函數值 綜合評價 μ1丙二醛μ2脯氨酸μ3質膜透性μ4葉綠素μ平均數排序1CIAT251180.5430.5160.3850.3010.436122CIAT56270.4900.5120.9960.6340.658230503210400.1980.1780.0880.3800.2111840503200260.7800.4900.6860.2350.548550204010490.8540.4110.1260.1050.374136CIAT56310.7550.5740.0000.1460.3691470711030141.0000.5480.5170.1910.564480203010040.8600.7140.4640.0000.5101090602190040.7160.4980.8780.4430.6343100503210380.3000.2920.6140.1730.34517110503200200.7760.4390.8610.0750.5389120503200270.0000.9111.0001.0000.7281130602190030.4250.0810.9950.2470.4371114CIAT51890.8500.2100.5490.5440.5388150503200210.5330.1760.8350.6130.5397160710290010.7341.0000.4250.0000.5406170503190080.6520.0000.5770.2130.3611518南021390.0780.4050.4850.4360.35116

圖1 不同距瓣豆耐鹽性聚類圖

2.2 距瓣豆鹽脅迫的綜合評價

2.2.1隸屬函數分析

在鹽脅迫第15天時，對鹽濃度8 g·L-1條件下測定葉綠素、質膜透性、脯氨酸、丙二醛進行隸屬函數分析。除CIAT 873、050321057距瓣豆死亡外，剩下的18份距瓣豆種質的耐鹽性強弱排名為：050320027>CIAT 5627>060219004>071103014>050320026>071029001>050320021>CIAT 5189>050320020>020301004>060219003>CIAT 25118>020401049>CIAT 5631>050319008>南02139>050321038>050321040。

2.2.2各材料耐鹽相似性分析

將不同品種距瓣豆的隸屬函數平均值進行SPSS 18.0聚類分析(平方Euclidean距離)，結果(圖1)表明，聚類后分為兩類：分類Ⅰ(耐鹽性強)：050320020、CIAT 5189、050320021、071029001、050320026、071103014、020301004、CIAT 5627、060219004、050320027；分類Ⅱ(耐鹽性弱)：CIAT 25118、060219003、050321038、南02139、020401049、CIAT 5631、050319008、050321040。

3 討 論

植物的耐鹽機理受多個基因控制，并使多個生理生化代謝過程發生改變[25-26]，從而影響植物的生長發育[27]。一般情況下，當土壤鹽含量大于0.3%時，植物就會受到鹽害，表現為生長緩慢，植物組織、器官生長和新陳代謝受到抑制、植株萎蔫甚至枯死[28-30]。

通過不同試驗證明，在植物受逆境脅迫時，它的生理指標會出現不同程度的變化，其中葉綠素隨著鹽濃度處理時間增加呈下降趨勢，這是由于葉綠素酶受到鹽作用活性增強，促進葉綠素降解[31-33]。質膜透性隨著鹽濃度增加呈上升趨勢[34-35]；脯氨酸隨著鹽濃度增加都呈現下降趨勢[36-37]；丙二醛有所不同，耐鹽植物的丙二醛含量波動不明顯，但不耐鹽品種則隨著鹽濃度增加而呈上升趨勢[38-39]。這均與本試驗中距瓣豆鹽處理的結果一致。

單一指標評價植物抗逆性是片面的，目前研究多采用科學、合理的隸屬函數法進行綜合評價[40]。在本研究中通過采用隸屬函數法對18份距瓣豆屬種質耐鹽性進行了綜合評價，發現它們的耐鹽能力強弱為：050320020>050321040>071029001>050321057>050319008>CIAT 5189>020301004>060219003>CIAT 25118>南02139>050320021>020401049>050320026>050321038>CIAT 873>CIAT 5631>CIAT 5627>060219004>050320027>071103014。

4 結 論

對20份距瓣豆種質材料在不同鹽濃度下測定了葉綠素、丙二醛等生理指標，試驗發現，在不同脅迫天數及不同脅迫濃度時，各品系間均存在不同程度的差異，隨著鹽脅迫天數的增加，葉綠素含量和質膜透性隨之降低，脯氨酸和丙二醛隨之增加。在鹽脅迫第15天時，對20份距瓣豆材料進行隸屬函數分析，耐鹽能力強弱為：050320020>050321040>071029001>050321057>050319008>CIAT 5189>020301004>060219003>CIAT 25118>南02139>050320021>020401049>050320026>050321038>CIAT 873>CIAT 5631>CIAT 5627>060219004>050320027>071103014。將隸屬函數分析結果進行了聚類分析，當R2=0.329，可分為兩類：第Ⅰ類(耐鹽型種質)：CIAT 25118、CIAT 5627、CIAT 873、050320026、020401049、CIAT 5631、071103014、020301004、060219004、050321038、050320020、050320027、CIAT 5189、050320021、南02139距瓣豆；第Ⅱ類(不耐鹽種質)：050321040、060219003、050321057、071029001、050319008距瓣豆。