花椒提取物對肝癌細胞HepG2細胞增殖和凋亡及Nrf2/ARE信號通路的影響

米凱 黃銳（通訊作者）

（1核工業四一六醫院<成都醫學院第二附屬醫院>普外科 四川 成都 610501）

（2四川省醫學科學院<四川省人民醫院> 四川 成都 610072）

肝細胞癌（hePatocellular carcinoma，HCC）病情隱匿，早期極難發現，95%的患者在確診時已為晚期[1]。由于肝癌細胞對放化療藥物具有一定抗性，目前除了早期手術切除外，尚無有效治療方法[2]。肝癌產生的本質歸結于細胞程序性死亡被阻斷導致的細胞無限增殖，因此誘導癌變細胞重新進入凋亡和生長抑制途徑將給肝癌治愈帶來根本性改變[3]。研究表明，花椒提取物具有止痛、抗氧化、抗炎、還原劑等作用的同時還具有抗腫瘤作用[4]。但有關花椒提取物對肝癌細胞的作用報道少見，因此，本實驗研究花椒提取物對人肝癌HePG2細胞增殖、凋亡及Nrf2/ARE信號通路的影響，為探索肝癌的高效靶向治療聯合用藥提供新思路。

1.資料與方法

1.1 花椒提取物制備

花椒（原產地四川）仔細剔除花椒種子等雜質，稱取200g，經無菌蒸餾水沖洗后經75%酒精沖洗一次，投入4000mL 75%酒精室溫浸泡24h后過濾，棄濾渣，得浸出液，將浸出液減壓蒸餾后獲得濃縮原液，使用真空冷凍干燥機對原液進行冷凍干燥，得粉末，置入干燥器備用。精密天平準確稱量200mg干燥粉末用1mL二甲基亞砜（DMSO）溶解，0.22μm一次性濾器過濾除去不溶解雜質，得ZMBE，放入4℃冰箱保存，使用前用DMEM培養基稀釋ZMBE藥物到所需濃度[5]。

1.2 細胞培養

HePG2肝癌細胞（南京凱基生物）在含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的DMEM高糖培養基中，置于溫度37℃、含5%CO2培養箱培養，取對數生長期細胞，分成對照組和ZBME組。對照組加入DMSO，花椒提取物組加入溶解于DMSO的ZBME：8μg/mL，37℃孵育48h后，收集所有細胞。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖能力

取收集的細胞，按照CCK-8檢測試劑盒（北京索萊寶生物）說明檢測，將各組細胞按每孔3×103個細胞接種于96孔板，加入100μL完全培養液于37℃、含5%CO2培養箱，培養48h后，每孔加入10μL CCK-8，繼續培養4h后用酶標儀檢測各組細胞在450nm處的吸光度值（A），細胞增殖活力（%）=（A實驗組-A對照組）/A對照組×100%。

1.4 流式細胞技術檢測細胞凋亡

取收集的細胞，按Annexin V-PI說明書（北京索萊寶生物）檢測，各實驗組細胞以5×105/mL的密度接種于6孔板中，培養48h后取出6孔板，用PBS清洗細胞表面殘留的培養液，常規重懸后加入AnnexinV APC、7-AAD，輕輕搖動，使其混合均勻，室溫避光孵育15min，上流式細胞儀（美國BD）檢測，總凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。

1.5 實時熒光定量PCR檢測

采用RNA提取試劑盒（Invitrogen）提取細胞總RNA，測定A260和A280吸光度值，電泳確定RNA的完整性后，依據mRNA反轉錄試劑盒說明，合成cDNA，用PCR儀擴增，實驗結果在熒光定量操作系統中進行分析對比，采用2-ΔΔCt對血紅素加氧合酶-1（HO-1）、醌氧化還原酶-1（NQO1）、ARE mRNA表達進行相對定量。

1.6 統計學方法

數據采用SPSS20.0統計軟件進行統計學分析，計數資料采用率（%）表示，進行χ2檢驗，計量資料采用（）表示，進行t檢驗，P＜0.05為差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 花椒提取物對細胞增殖、凋亡的影響

細胞增殖、凋亡實驗結果顯示，花椒提取物組的細胞增殖顯著低于對照組（P＜0.01）；細胞凋亡花椒提取物組顯著高于對照組（P＜0.01）；見表1，圖1。

表1 不同處理組細胞增殖、凋亡比較（）

表1 不同處理組細胞增殖、凋亡比較（）

組別 n 細胞增殖 細胞凋亡花椒提取物組 3 0.77±0.02** 14.94±1.58**對照組 3 1.01±0.05 5.63±0.92 t 10.090 8.802 P＜0.001 0.001

圖1 細胞凋亡

2.2 花椒提取物對Nrf2/ARE信號通路因子的影響

qRT-PCR結果顯示，花椒提取物組的HO-1、NQO1、ARE mRNA表達顯著高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 不同處理組HO-1、NQO1、ARE mRNA表達

3.討論

肝細胞癌（HCC）的發生發展是由多步驟、多因素、多基因共同參與而導致的結果，其與肺癌、胰腺癌一起被稱為病死率最高的三大癌癥[6]。目前臨床治療晚期肝癌靶向藥物價格昂貴，給我國眾多肝癌患者治療帶來極大不便。因此，本研發具有良好抗肝癌效果且適合我國國情的藥物，為肝癌治療提供依據。

花椒具有較高的食用和藥用價值，其具有較強的抗氧化性、消除自由基、抗腫瘤效果[5]。目前已證實花椒提取物可以誘導多種惡性腫瘤細胞凋亡[7]。本實驗結果顯示花椒提取物具有直接抑制肝癌HePG2細胞的作用，CCK-8檢測發現花椒提取物組的細胞增殖顯著低于對照組（P＜0.01）；流式細胞術Annexin V/PI雙染色觀察到細胞凋亡花椒提取物組顯著高于對照組（P＜0.01）。提示花椒提取物抑制肝癌HePG2細胞的增殖并促進肝癌HePG2細胞的凋亡是其抑制肝癌細胞增殖、生長的主要途徑之一。

Nrf2/ARE信號通路能夠啟動下游多種保護性基因的表達，已證實Nrf2/ARE信號路徑調節的可編碼內源性保護基因超過200個[8]。ARE是一個特異的DNA-啟動子結合序列，其可保護細胞組織正常功能。HO-1可與其酶降解產物共同發揮抗炎、抑制細胞凋亡等作用，是機體最重要的內源性保護體系之一。NQO1是一種調節細胞物質處于氧化還原狀態的黃素酶，對各種代謝引起的氧化應激反應具有保護作用。本試驗結果顯示，花椒提取物組的HO-1、NQO1、ARE mRNA表達顯著高于對照組（P＜0.05），提示花椒提取物可激活Nrf2/ARE信號通路。

綜上所述，花椒提取物可抑制肝癌細胞增殖，促進肝癌細胞凋亡，并激活Nrf2/ARE信號通路，達到抗癌作用。但由于花椒提取物成分復雜，含量不一，其具體的抗腫瘤作用機制有待進一步深入研究。