異亮氨酸生產菌的全局代謝網絡改造策略

【摘要】L-異亮氨酸是一種支鏈氨基酸，也是人體必需氨基酸，可作為食品營養補充劑、藥物和飼料添加劑。本文主要綜述了谷氨酸棒桿菌、大腸桿菌合成L-異亮氨酸的調控機制和全局代謝網絡改造策略現狀，重點闡述基因工程技術在 L-異亮氨酸產生菌改造中的應用。

【關鍵詞】L-異亮氨酸 基因工程 改造策略

【中圖分類號】R459.7???? 【文獻標識碼】A?????? 【文章編號】1004-7484（2019）10-0035-02

【Abstract】 L-isoleucine is a branched-chain amino acid and an essential amino acid for humans. It can be used as a food nutrition supplement， medicine and feed additive. This article mainly reviews the control mechanism of L-isoleucine synthesis by Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli and the status of global metabolic network transformation strategies， and focuses on the application of genetic engineering technology in the transformation of L-isoleucine producing bacteria.

【Keywords】 L-isoleucine? genetic engineering? modification strategy

異亮氨酸是一種支鏈氨基酸，也是人體必需氨基酸，在食品領域主要用于食品添加劑，在醫藥領域主要用于氨基酸輸液成分之一，而且它的需求量在逐年增加[1]。傳統意義上的L-異亮氨酸生產菌株大多數是由野生菌株經過物理或化學的方法經過多輪誘變篩選獲得。研究發現，基因突變往往充滿著很多不確定性，而且在高通量篩選菌種時工作量較大，此外反復使用同一種誘變因子可能會出現鈍化現象并且引起微生物的回復突變，使誘變育種變得不易控制[2]。基因工程技術的發展為L-異亮氨酸高產菌株的篩選提供了全新選擇，該技術主要基于目前研究人員對L-異亮氨酸合成途徑和調控機制的深入了解，定向改造有利于L-異亮氨酸合成的某些基因或其代謝途徑，使碳源最大化流向L-異亮氨酸同時解除L-異亮氨酸的自身反饋抑制，因此利用這種方法獲得的L-異亮氨酸高產菌株產量高且遺傳性狀穩定。

1L-異亮氨酸的合成途徑與調控機制

谷氨酸棒桿菌是L-異亮氨酸生產菌的常用菌株，其產L-異亮氨酸的生物合成途徑、調控機制及其運輸系統如圖1所示。L-天冬氨酸首先經過L-天冬氨酸激酶（AK）、天冬氨酸半醛脫氫酶（ASD）、高絲氨酸脫氫酶（HDH）、高絲氨酸激酶（HSK）和蘇氨酸合酶（TS）催化的五步酶學反應轉化生成L-蘇氨酸[3]。AK 由lysC基因編碼合成，其活性受到 L-蘇氨酸和L-賴氨酸協同反饋抑制，是L-異亮氨酸合成途徑上的第一個關鍵酶;HDH由hom基因編碼，是L-異亮氨酸合成途徑上的第二個關鍵酶，調控HDH催化的酶反應是控制碳流流向支路的關鍵之處，其表達受到L-甲硫氨酸的輕微反饋阻遏;HSK是由thrB基因編碼，可將高絲氨酸磷酸化形成磷酸高絲氨酸，可控制流向蘇氨酸合成的碳流，其酶活性受到L-甲硫氨酸和L-蘇氨酸的反饋抑制，是L-異亮氨酸合成途徑上的第三個關鍵酶;蘇氨酸脫水酶（TD）對蘇氨酸的脫氨基，可控制L-蘇氨酸到L-異亮氨酸的碳流，是L-異亮氨酸合成途徑上的第四個關鍵酶;乙酰羥基氨酸合酶（AHAS）催化丙酮酸和2-酮基丁酸生成乙酰羥丁酸，由于該酶還可以催化合成L-纈氨酸和L-亮氨酸，所以其決定了不同產物的碳流，是L-異亮氨酸合成途徑的第五個關鍵酶[4-5]。

大腸桿菌是另一個常用的L-異亮氨酸生產菌株，它的L-異亮氨酸生物合成途徑及調控機制如圖2所示，與谷氨酸棒桿菌略有區別[6]。L-天冬氨酸先經五步反應合成L-蘇氨酸，L-蘇氨酸再經五步反應后生成L-異亮氨酸，與谷氨酸棒桿菌不同的是AK有三個同工酶為AKⅠ、Ⅱ和Ⅲ，分別由thrA、metL和tysc編碼。AKⅠ、Ⅱ和Ⅲ具有不同的調控機制，在基因水平上，thrA和tysc的表達分別由L-蘇氨酸和 L-賴氨酸誘發的轉錄衰減調控，而metL 的表達則由 L-甲硫氨酸誘導的阻遏蛋白MetJ調控在蛋白質水平上，AKI和AKⅡ是雙功能蛋白，同時具有天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶的活力，分別受 L-蘇氨酸和L-賴氨酸的反饋抑制調控。大腸桿菌中有三個乙酰羥基酸合成酶（AHAS）的同工酶，分別為AHASⅠ、Ⅱ和Ⅲ并分別由由ilvBN、ilvGM和ilvlH編碼與AK類似，這三種同工酶具有不同的調控機制。ilvGM的表達由L-異亮氨酸誘發的轉錄衰減調控。這三種AHAS同工酶競爭同一個底物丙酮酸，丙酮酸是支鏈氨基酸合成的重要前體，相比之下ilvBN編碼的AHASI對丙酮酸的親和力遠高于對2-酮基丁酸的親和力。因此，AHASI主要參與 L-亮氨酸和L-纈氨酸的生物合成，而AHASⅡ和Ⅲ主要參與L-異亮氨酸的合成[7]。

2 L-異亮氨酸的代謝工程改造

2.1運輸載體改造對L-異亮氨酸產量的影響研究發現，L-異亮氨酸的產率與跨膜轉運機制有密切的關系。Morbach S等對谷氨酸棒桿菌發酵生產L-異亮氨酸的研究發現胞內L-異亮氨酸濃度始終大于胞外L-異亮氨酸濃度[8]，Kelle R等人發現高濃度的L-異亮氨酸對細胞有毒害作用[9]。BrnFE是谷氨酸棒桿菌中負責支鏈氨基酸L-異亮氨酸、亮氨酸和纈氨酸轉運運輸的雙組份轉運載體，由brnFE 基因編碼，當谷氨酸棒桿菌胞內的支鏈氨基酸量積累到一定程度時，便會激活 brnFE 操縱子表達使得L-異亮氨酸等氨基酸外排到胞外。通過過表達 brnFE 基因，可以減少 L-異亮氨酸在谷氨酸棒桿菌胞內的積累，削弱L-異亮氨酸在胞內對合成途徑中關鍵酶的反饋抑制作用，從而增加其產量。李忠財等人在谷氨酸棒桿菌LD320 中分別過表達突變型和野生型的雙組份轉運系統BrnFE操縱子，構建了重組菌LD320pXMJ19-brnFE1通過添加適量的表面活性劑，通過7L發酵罐放大實驗，發現該菌株L-異亮氨酸的產量由18.53 g/L提高到25.45 g/L[10]。大腸桿菌中，支鏈氨基酸（BCAAs）的輸出蛋白brnFE高效表達也可提高L-異亮氨酸產量。

2.2 輔酶改造對L-異亮氨酸產量的影響L-異亮氨酸所需的關鍵輔酶是NADPH，它也是ASD、HD、乙酰羥酸合酶（AHAIR）的輔酶，此外NADPH還是細胞內最重要的還原力在還原性生物合成中起到氫供體的作用。細胞內NADPH的主要供應渠道是HMP途徑和NAD激酶，其中HMP途徑利用氧化態輔酶Ⅱ（NADP+）作為電子受體生成還原態輔酶Ⅱ（NADPH），NAD激酶則催化輔酶Ⅰ發生磷酸化生成輔酶Ⅱ。研究表明，高效供應NADPH有利于發揮菌株的合成潛力，可促進L-異亮氨酸的進一步積累。還曉靜等人通過在谷氨酸棒桿菌中過表達NAD激酶（ppnk編碼）成功構建由ppnK組成表達菌JHI3-156/pDXW-9-ppnK，L-異亮氨酸的產量提高了41.7%[11];Shifeng等人利用輔酶工程在谷氨酸棒桿菌中增加NADPH的供應，敲除內源性NAD+激酶基因ppnK同時將葡萄糖-6磷酸脫氫酶基因zwf與L-異亮氨酸雙加氧酶（ido）共表達提高L-異亮氨酸的前體物質4-羥基異亮氨酸（4-HIL）的產量，L-異亮氨酸產量達到84.14±6.38mM[12]。

2.3 代謝通路改造對L-異亮氨酸產量的影響

2.3.1增強主合成途徑

2.3.1.1通過表達關鍵酶以解除自身反饋根據L-異亮氨酸的生物合成途徑及代謝調節機制，使菌體最大化生成L-異亮氨酸的方法主要是增加其前體物質的合成、解除自身反饋抑制以及切斷代謝支路。通過基因工程手段能很好地改造L-異亮氨酸產生菌的代謝通路，例如過表達某些關鍵酶基因可以有效解除自身反饋抑制、敲除支鏈代謝的相關基因可以使碳流最大化流向目標產物?；蚬こ淌侄尉珳是矣行У馗淖僉-異亮氨酸產生菌的代謝通路，已成為很多研究者青睞的方法。尹良鴻等人在谷氨酸棒桿菌JHI3-156中共表達反饋抗性蘇氨酸脫水酶和乙酰羥基酸合酶，經72小時分批補料發酵可生產L-異亮氨酸30.7 g/L[13];徐慶陽等人通過在谷氨酸棒桿菌中過表達hom基因成功構建谷氨酸棒桿菌 YILW（pXMJ19-hom），由于解除了高絲氨酸脫水酶的反饋抑制，使得L-異亮氨酸的產量增加了10.3%，達到32g/L[14];此外他通過異源表達鈍化發現谷氨酸棒桿菌JHI3-156的蘇氨酸脫水酶（TD1）和乙酰羥基胺酸合酶（AHAS1）均具有抗反饋抑制能力，在谷氨酸棒桿菌JHI3-156中過量表達TD1或AHAS1均能提高L-異亮氨酸的產量，組合表達時搖瓶發酵提高131.7%的L-異亮氨酸，發酵罐發酵提高26.3%的L-異亮氨酸;李燕軍等人以L-蘇氨酸生產菌Escherichia coli THRD為出發菌株，利用基因重組技術替換 ilvLXGMEDA啟動子并過表達解除L-異亮氨酸反饋抑制的ilvA和ilvIH，獲得了L-異亮氨酸高產菌株ILE04，該菌株在5L發酵罐中L-異亮氨酸的產量為5.23g/L[15];溫冰、徐國棟等人采用基因重組手段將L-異亮氨酸生產菌株谷氨酸把那個桿菌YILW的 ilvBNC操縱子中的啟動子替換為強啟動子Ptac獲得谷氨酸棒桿菌YILWPtacpXMJ19cimA，其L-異亮氨酸酸產量和核糖轉化率分別較出發菌株提高14.8%和18.6%，在此基礎上過表達cimA基因，L-異亮氨酸產量和糖酸轉化率較出發菌株提高了14.5%和42.4%[16]。

2.3.1.2增加前體物質的合成異亮氨酸的前體物質主要有天冬氨酸，蘇氨酸等，增加相關的前體物質能積累大量的目標產物。Feng Shi等人在重組谷氨酸棒桿菌中過表達基因ppc（編碼PEPC-磷酸烯醇丙酮酸羧化酶）和lysC（編碼AK）再將ppc和lysC與ido共表達以增加4-HIL的直接前體L-異亮氨酸的供應[17];乙酰羥基酸合成酶（acetohydroxyacid synthase， AHAS）是L-異亮氨酸合成途徑的關鍵酶（L-由 ilvBN 編碼），α-酮基丁酸是 L-異亮氨酸合成的重要前體，因此強化 ilvBN 的表達以及增加α-酮基丁酸的供應理論上可提高L-異亮氨酸的合成。趙建勛在谷氨酸棒桿菌IWJ001中表達RRF和EF-G，后續共表達合成途徑關鍵酶基因ilvBNA和輔酶基因ppnk，L-異亮氨酸產量提高了76.5%[18]。

2.3.1.3增強回補途徑以增加L-異亮氨酸的產量增強回補途徑是增加L-異亮氨酸產量的重要方法，研究表明回補途徑的增強確實可以提高L-異亮氨酸的產量。ZHU Fuzhou等人以谷氨酸棒桿菌Y1為出發菌株，采用基因組整合和質粒過表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶編碼基因ppc及丙酮酸羧化酶編碼基因pyc，獲得pyc基因組整合和質粒過表達菌株ILE01，搖瓶條件下L-異亮氨酸產量提高了17.3%，發酵罐條件下提高11.7%;獲得ppc基因組整合和質粒過表達菌株ILE03，搖瓶條件下L-異亮氨酸產量提高了30.8%，發酵罐條件下提高15.8%[19]。

2.3.2減少副產品的積累在L-異亮氨酸的合成途徑上，其他氨基酸等競爭代謝產物的存在極大減少了L-異亮氨酸的合成，支鏈代謝產物會分走很大部分碳流，理論上減弱這些旁路氨基酸的合成，可以大大加強L-異亮氨酸合成途徑的碳流從而積累更多的L-異亮氨酸。Yuanxiao DONG等人通過敲除ddh和lysE基因，從野生型谷氨酸棒桿菌ATCC13869中構建不產生賴氨酸的基礎菌株，通過過表達相關基因L-異亮氨酸的產量有明顯提高[20]。

3 總結及展望

傳統上主要結合隨機突變、定向篩選高產L-異亮氨酸高產菌，但是由于突變的不確定性且篩選工作量大等原因，目前菌種改造多采用基因工程手段?；蚬こ淌侄我跃甏x背景清楚為前提，對一個點或多個點進行基因水平上的改造，對代謝途徑中多個關鍵酶高效表達以解除一些反饋抑制，此外構建新的代謝途徑逐漸走入人們視野。本文主要概述了L-異亮氨酸生產菌的全局代謝網絡改造策略以及基因工程在L-異亮氨酸生產菌全局代謝網絡改造中的應用現狀，旨在為相關研究者提供一些參考。當前，我國的相關研究也處在剛剛起步的階段，隨著系統生物學等相關學科的不斷發展，將相關學科的新技術相互結合用于選育更高產L-異亮氨酸的菌株成為新的挑戰和發展方向，并且提出更精準、更全面、更合理的改造策略，使得L-異亮氨酸成本降低且產量有明顯的提升以滿足日益增長的生產生活需要。

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作者簡介：李曉芳（1994.9-）女，內蒙古自治區興安盟突泉縣，漢，研究生，寧夏大學食品與葡萄酒學院，研究方向：微生物育種。