無標記和標記表面增強拉曼光譜技術用于細菌的檢測

楊 尹， 梁偉偉， 王小華*，沈愛國*， 胡繼明

(生物醫學分析化學教育部重點實驗室，武漢大學化學與分子科學學院，湖北武漢 430072)

1 前言

快速準確檢測水源和食物中的病原體微生物對于食品安全和人們健康至關重要[1]。常見的水源和食源性病原體微生物包括大腸桿菌、嗜肺性軍團病桿菌、沙門氏菌和鼠傷寒沙門氏菌等等。這些細菌可以誘發產生很多嚴重甚至致命性的疾病，而對這些細菌的快速和靈敏的檢測可以預防和控制這些相關疾病。上世紀建立的檢測病原體微生物的平板計數法固然可靠，但它依賴于多重培養與富集并且非常耗時[2]。除此之外的其他方法，如流式細胞計數，酶聯免疫吸附測定和聚合酶鏈式反應等，在靈敏度、特異性等方面均存在一定的局限性，且檢測用時較長、成本偏高[3 - 5]。所以急需開發一種快速、靈敏、實用、低成本的細菌檢測方法。

表面增強拉曼光譜(SERS)檢測因其具有無損、高分辨率、耗樣量少、制樣簡單、原位快速準確等優點，為快速檢測細菌種類提供了一種新的技術手段。本文基于標記和無標記兩種方式，對SERS技術用于細菌檢測的現狀進行總結和介紹。

2 SERS技術及增強機理

眾所周知，常規拉曼光譜的最大不足在于信號強度低及靈敏度不高。1974年Fleishmann等人發現吸附在粗糙Ag電極上的吡啶分子的拉曼信號大大增強。1977年Jeanmaire等人對這一現象進行了深入研究并總結了該現象的增強機理，統稱之為表面增強拉曼散射效應，以此得到的拉曼光譜稱之為表面增強拉曼光譜(SERS)[6 - 7]。SERS被發現后立刻引起了廣泛的關注，在隨后的幾十年里有大量科研工作者圍繞這個新發現開展了研究，SERS相關機理及應用日益深入，尤其是在分子分析、催化監控、信號傳感等領域得到廣泛的應用。

2.1 SERS增強機理

經過四十多年的發展，SERS的理論研究取得了較大的進展。電磁增強機理在SERS增強機理研究中占據主導地位，該機理認為SERS增強主要是由入射光和電場在局域等離子體表面上的耦合作用，且拉曼的增強因子與待測物質及材料表面間距離以及接觸面的曲率有關，而納米材料的形狀、尺寸對電磁增強長程效應有決定作用。雖然電磁增強理論在信號增強中起著主要作用，但是仍然無法完全解釋所有的SERS現象，隨后一些學者們提出化學增強以做補充。兩種貢獻的SERS機理見圖1。經實驗證實，目標分子靠近到等離子體表面后，體系中的各分子能級間會出現電子共振轉移，當目標分子與納米材料表面作用時會引起分子本身電荷的再分布，引起分子極化率的改變，從而增加分子極化率，即拉曼振動增強[8 - 9]。經理論計算及實驗證實，納米顆粒粒徑在20～100 nm貴金屬材料的增強因子可達到104～105，而當分子與納米顆粒直接接觸時，增強因子還可以提升1～2個數量級。但粒徑減小會導致表面等離子體共振(SPR)過小，粒徑過大導致SPR活躍度減弱，這兩種情況均會影響SERS增強因子[10 - 11]。SERS強度可以根據一個常見的公式[12]來簡要解釋。

圖1 兩種貢獻SERS機理Fig.1 Two mechanisms contributed to SERS

2.2 SERS增強基底

具有SERS活性的納米粒子對SERS的增強效果有著關鍵的作用。在過去幾十年中，人們制備了各種種類和形狀的納米粒子，比如納米棒、納米立方體、納米星、納米花生、納米片、納米三角和納米線[13 - 16]。研究者們可以通過合理設計和控制納米粒子的尺寸、形狀和材料，優化SERS增強體系[17 - 18]。Au和Ag是最常見的兩種增強材料。Au納米材料由于其優異的生物相容性而經常用與細胞或體內研究，Ag納米材料由于其對生命系統有較強毒性，很少用于體內分析，但是其優異的增強性能有利于體外超靈敏檢測。除此之外，一些半導體材料也有SERS活性，復合材料由于它們的協同作用和本身性能可以使SERS基底得到有效改進。在單分散納米顆粒的SERS基底中，末端曲率半徑小的納米粒子產生的超強局部電磁場具有非常大的增強因子，當納米顆粒相互接觸時將會在它們的接觸區域產生強烈的局部電磁場增強效應，會產生1010以上的增強因子[19]。因此，基于SERS活性基底可以對目標分析物進行超靈敏檢測。

3 細菌檢測的SERS方法

基于細菌檢測的SERS傳感可以分為無標記和標記SERS方法兩種。每種細菌都具有內源SERS，因此無標記SERS方法可以通過直接檢測吸附在活性基底表面細菌的SERS來對細菌進行鑒別和定量。這種方法獲得的信息直接與細菌種類有關，但往往缺乏相應的各種細菌拉曼光譜信息的標準數據庫，且靈敏度有待進一步提高。標記SERS方法是采用尖銳的拉曼光譜譜峰和靈敏度高的物質作為光學標記，SERS標簽上的抗體或適配體與細菌特異性結合并構建夾心結構，其原理與傳統的熒光染料標記和熒光量子點標記等非常相似。兩種模式如圖2所示[20]。

圖2 用于細菌檢測的標記(A)和無標記SERS法(B)[20]Fig.2 Schematic illustration of label based (A) and label-free based (B) SERS method for bacteria detection[20]

3.1 無標記型SERS方法

無標記SERS方法通常是在溶液中使納米顆粒的SERS活性基底與細菌細胞直接接觸或者結合，亦或是將細菌附著在SERS固態基底上，用可見或近紅外激光激發，獲得細菌的SERS譜圖，建立數據庫，然后根據統計學分類方法將所獲得的細菌SERS譜圖進行分類鑒定等研究。當細菌與SERS基底接觸時，只有垂直于SERS基底表面的細菌部分組分的振動模式才會增強，其他的振動模式由于“遠程效應”的影響，增強效應并不明顯。此外，增強基底的粒徑與形狀和激發波長也有較大的影響。所以，不同文獻報道的SERS也不盡相同[21]。

3.1.1 SERS基底(1)SERS固相基底：單分散的Ag球經組裝后產生的熱點可以分別鑒別典型的致病微生物大腸桿菌與金黃色葡萄球菌，并且還可以鑒定細菌是否有生命特征[22]。新穎的的三維納米結構陣列構成的SERS增強基底，成功應用于臨床及自然環境中常見七種副溶血性弧菌菌株的檢測鑒定，但它們均未能較好地實現定量檢測。實驗表明，增加細菌與等離子體顆粒的有效接觸面積可以提高細菌檢測靈敏度。萬古霉素(Van)是一種常見的抗生素，借助羰基和蛋氨酸的胺基可以與細菌細胞壁上的肽聚糖發生強效鍵合，Van可與肽聚糖形成穩定的鍵合作用進而拉近細胞壁部分結構與SERS增強基底之間的距離，從而產生SERS熱點，使本來較微弱的SERS信號增強[23 - 24]。由于修飾有Van的Ag納米材料的基底只與革蘭氏陽性(G+)細菌具有鍵合作用，所以只能鑒定出G+細菌[25]，隨后研究發現修飾有Van的Ag-Au 納米SERS基底對G+和革蘭氏陰性細菌(G-)都有很好的SERS增強效果[26]。雖然此類借助固態SERS基底方式可以提供重現性較好的SERS譜圖，但是復雜的合成過程和高成本限制了其應用。

(2)貴金屬溶膠：相比于上述提到的二維或三維SERS基底，貴金屬溶膠制備過程往往更簡便。對于細菌檢測，無標記SERS通常采用單分散的Au納米粒子(AuNPs)或AgNPs或顆粒聚集體，在無機鹽協助下簡單地與細菌細胞混合[27]。雖然簡單的混合方式使檢測更加簡單、快速，但是所形成的混合物并不總是同質的，納米顆粒的分布隨機性太強，導致所獲得的病原體細胞表面SERS的重復性較差，對于細菌的鑒定或者檢測都不具有代表性。所以基于貴金屬納米顆粒的SERS方法主要是使納米顆粒盡可能多地接觸細菌表面位點。AgNPs因其優越的SERS增強效果已被廣泛用于檢測[28]。常見的結合方式主要有共培養[29]、靜電結合[30]、原位還原[31]、靜電和原位的結合[32]等，見表1。

表1 基于AgNPs的無標記SERS探針用于微生物的檢測

由于細菌細胞壁上的脂多糖和磷壁酸帶負電荷從而使細菌整體顯示負電性，聚烯丙基胺鹽酸鹽(PAH)與AuNPs的逐層結構帶正電，由于靜電吸引，其可以高效地聚集在細胞壁上，因而實現單細菌的SERS檢測。但合成這種逐層結構過程比較復雜，而通過合成帶正電的AgNPs與細菌直接地靜電結合可以簡化步驟[33]，但是此方法也沒有進行量化實驗。簡而言之，原位還原方法可以在細菌細胞壁表面生成納米顆粒，使其比較均勻地遍布在細菌細胞壁上。實驗結果表明，通過靜電作用在細菌細胞壁上原位制備的AgNPs可以有效增強細菌SERS效應，從而獲得重復性比較好的SERS譜圖，此方法可以成功應用至飲用水中的細菌檢測[34]。在對SERS信號的增強能力上，這種原位方法明顯優于簡單混合或共培養的方法，其檢出限是2.5×102cell/mL。此外，一種原位還原的方式是借助NaBH4，在采用Triton X-100預處理的細菌表面還原產生AgNPs，獲得的細菌檢測限低于1 000 cell/mL，可實現大腸桿菌(E.coli)，銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和李斯特菌(Listeria)分類及鑒定[35]。另外，實驗發現細菌的SERS強度很大程度上與其表面的Zeta電勢有關，利用該特征可以將野生型和耐抗生素細菌進行分類鑒別，并且發現不同活性狀態下細菌的電勢也有差異，從而可區分出活和死細菌[36]。

(3)多功能的SERS基底：類似過濾結構的金介孔納米材料[37]、爆米花狀磁芯金殼納米顆粒[38]等多功能的SERS探針用于細菌分離或者濃縮，實現細菌的SERS高靈敏檢測。修飾有氧化石墨烯(GO)的爆米花結構AuNPs的SERS探針，其SERS具有良好的重復性，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的檢出限為10 cell/mL[39]。有些SERS探針兼具較好光熱效應，可以殺死耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。

3.1.2 影響無標記細菌SERS特征的因素激發波長和納米材料種類對細菌的SERS有很大的影響。當用激發波長為514或633 nm的激光照射時，在Ag或Au膠體上所獲得的大腸桿菌、黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)和核黃素(RF)的SERS是存在差異的[26]。首先對于E.coil，在其細胞外部利用NaBH4還原AgNO3或HAuCl4生成溶膠顆粒，在514 nm激發光激發下，E.coil的SERS譜圖與FAD及其RF都非常相像。其中，FAD和RF在450 nm位置處都有明顯的吸收，持續到520 nm位置處，在該激發波長下，無論FAD還是RF都存在預共振效應，SERS信號從而得到增強，可以得出此時E.coil的SERS主要由黃素構成，遮蔽了細胞壁其他組分對光譜的影響。在633 nm激光下，排除黃素預共振對SERS的影響，發現除了歸屬到黃素的部分譜峰以外，譜圖中出現了其他位置的峰。AuNPs和E.coil混合之后產生的SERS譜峰大部分來源于其他組分，例如在該激發光下，735和1 330 cm-1位置的譜峰來源于腺嘌呤的振動。由此可知，不同激發波長或者不同種類納米材料對細菌SERS譜圖都有很大的影響，反之，也可以發現SERS手段在應用至細菌的另一個優勢：僅僅更換SERS增強效應的納米顆粒或調控激發波長就能改變細菌SERS。

細菌的生長階段也會影響細菌的SERS。有報道將細菌置于Ag/AAO底物上[27]，另一篇報道是將細菌與羥胺還原的AgNPs混合，然后置于CaF2玻片上[40]。這兩項研究的共同點都是利用未修飾的AgNPs作為基底材料，所獲取的SERS主要來源是細菌組成及其代謝分泌物。利用在600 nm處的吸光值(OD600)對培養基中的E.coil進行定量，根據OD600得到細菌的生長時間函數圖，OD600為0.4、1.5、2.0時，分別對應細菌的生長周期的中期、指數期和穩定期狀態，從這三個不同生長階所獲取的細菌，經離心充分洗滌后，獲得細菌的掃描電鏡(SEM)圖和SERS譜圖，根據SEM圖顯示細菌生長達到最大時，E.coil看起來有所“縮短”，縱橫比降低，與之對應的SERS光譜上也發生變化，比較明顯的是655、1 130、1 219和1 245 cm-1位置處的強度在指數階段向穩定階段過渡中增加，然而725和1 095 cm-1峰強是呈下降趨勢的。根據SERS發生的差異，結合相對應的SEM結構圖中形貌改變，可以初步說明細菌外側具有某些高度動態特性組分或者代謝物質。

細菌受到不同環境影響會作出響應應答，選擇性表達碳水化合物、蛋白質或者脂質等物質。有報道在對E.coil和表皮葡萄球菌的研究中，采用不同的化學物質和壓力條件處理細菌，包括滅活、饑餓和高溫，所獲得的細菌SERS與空白組相比差異顯著[38]。一組細菌在37 ℃條件下培養之后與檸檬酸鹽還原的AgNPs混合；另外兩組樣品在4 ℃和45 ℃分別處理245 min和64 min，之后再以相同條件和AgNPs混合。孵育過夜后，采用陶瓷過濾器過濾上述三組樣品后所獲取的SERS光譜[41]，存在顯著差異，尤其是在1 200至1 700 cm-1區域，盡管這些結果只能初步證明，但其仍然有用于直接監測細菌細胞膜及其代謝過程的潛能。已有研究報道將SERS技術應用至評估細菌對抗生素的敏感程度[42]。

在這些研究中，采用抗生素氨芐青霉素、苯唑西林、萬古霉素、頭孢噻肟、慶大霉素和四環素處理E.coil和S.aureus，然后將其放置在Ag/AAO SERS基底上，結果顯示SERS響應主要源于經由抗生素處理的細菌。目前，抗生素干擾細菌蛋白合成的SERS譜圖變化是很難在短時間被發現或者捕捉到的，至少在被抗生素治療9～12 h后才被發現[43]，這是因為即使在沒有新蛋白質合成的情況下，依然可以長時間保持細胞壁的完整性。

3.2 標記型SERS方法

由于細菌SERS信號來源尚無確切定論，同時缺乏標準的細菌SERS譜圖數據庫，無標記SERS方法在細菌領域中的研究尚未有較大突破。目前，采用特定的有機拉曼標記分子、目標識別分子和等離子體納米顆粒組裝成的SERS標記探針，形成放大的特征拉曼信號，用于間接檢測目標物質。標記型SERS探針具備的光學特性與采用有機染料和量子點的熒光探針類似，比如有機染料和量子點，但是標記型SERS探針具備其他探針無可比擬的特質：拉曼光譜的譜峰寬度僅為1 nm左右，拉曼光譜可以實現多組分在線同時檢測；SERS探針所提供的超高靈敏度可用于生物樣品的痕量分析；同時，SERS探針具有很強的光穩定性，可有效地避免光漂白和信號淬滅現象；拉曼位移不受激發光的頻率影響，因此可以通過選擇近紅外光源來避免生物體系中自發熒光干擾。

圖3 典型的用于細菌檢測的SERS探針Fig.3 Typical SERS tags for bacteria detection

在典型的SERS探針設計中(圖3)，拉曼信號分子和識別分子直接修飾到納米顆粒上從而提供增強的拉曼信號[44]。在SERS基底上修飾識別分子，如特異性抗體和適配體的作用為兩方面：一方面賦予SERS探針合適的生物相容性；另一方面賦予SERS探針靶向功能。但是貴金屬納米顆粒在生物體系中不穩定，受到多種因素干擾，導致SERS信號輸出受到影響[45]。所以通常會修飾多種表面保護劑到修飾有拉曼信號分子和識別分子的貴金屬納米顆粒表面，以提高納米粒子的穩定性。目前所使用的保護劑包括多聚物[46]、脂類物質[47]、硅層[48]等物質。因此，通常用于制備檢測細菌的SERS探針需要多項修飾過程，主要涉及底物合成、信標修飾、表面保護劑負載及識別部分修飾等過程。

標記型的SERS探針對細菌檢測的核心之一就是使其具備良好特異性。標記型的SERS探針的光學功能主要受以下因素影響：SERS活性底物，被修飾物質的組成及其濃度[49]。不同形狀的貴金屬納米粒子、復合納米粒子及其聚集體[50]可用作SERS活性底物，其SERS信號分子的增強因子增至108～1013數量級[51]。用于SERS標記的細菌檢測的標記分子目前有4-氨基苯硫酚、4-巰基苯甲酸、羅丹明6G、4-巰基吡啶、5,5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸等物質[52 - 54]。

3.2.1 抗體為識別分子的標記探針基于抗體的細菌SERS探針如Ag@SiO2NPs，爆米花形狀的金納米材料和金包單壁碳納米管[55]連接單克隆抗體，可以實現沙門氏菌或耐藥沙門氏菌菌株的檢測。此外，這樣的SERS測定方式還可以在15 min內使99%的耐藥性的沙門氏菌失活[56]。載有單域特異性抗體的SERS納米聚集體的探針，可用于實現對目標細菌的超靈敏檢測[57 - 59]。另外一種硅烷化的SERS探針(NAEBs)可以實現對細菌的超靈敏檢測，因為探針由硅層包裹，并且是AuNPs的聚集體，所以與裸露的Ag或Au相比更加穩定和適用，據報道它可以在1 h內實現病原菌細菌S.aureus單個細菌水平檢測[60]。在后續的研究中，為了進一步提高SERS探針對沙門氏菌的靶向特異性，Tay等人將探針修飾上來源于P22噬菌體的蛋白質，該蛋白可以靶向到沙門氏菌上的多糖物質，從而實現對沙門氏菌的特異性識別，進而達到單個沙門氏菌的超靈敏檢測。

3.2.2 適配體為識別分子的標記探針基于適配體的細菌SERS探針可以根據羅丹明6G(ROX)信號分子的拉曼強度變化，實時監測耐甲氧西林的S.aureus和沙門氏菌對光熱活性反應[61]。基于修飾有適配體的AuNPs的SERS生物傳感[62]，可以實現鼠傷寒沙門氏菌和S.aureus的檢測，其中S.aureus的檢出限為35 cell/mL，鼠傷寒沙門氏菌的檢出限為15 cell/mL。另外，有學者報道了Au@AgNPs-適配體1-目標物-適配體2-ROX的SERS傳感，對鼠傷寒沙門氏菌的檢測線性范圍為1.0×101到1.0×105cell/mL，檢出限為15 cell/mL[63]。相比抗體，適配體尺寸更小，合成和標記技術手段比較便宜、簡單，無需免疫原性[64 - 65]，所以適配體在SERS生物分析中更具有優勢。

3.2.3 戊二醛為識別分子的標記探針基于戊二醛(GA)的細菌SERS方法也有很多報道。GA是一種小分子物質，與細菌細胞壁上的肽聚糖具有很強的交聯特性。研究者制備出了一種新型的修飾有戊二醛的納米金-三(2,2′-聯吡啶基)氯化釕-氧化石墨烯多功能化的SERS探針，該探針可以捕獲并檢測S.aureus和E.coil，片狀結構的GO和GA的特性可以實現細菌的有效捕捉與交聯，既可以實現超靈敏的mapping成像，又可以借助光熱效果使細菌失活[66]。另外，借助磁性納米顆粒(MNPs)可以使SERS探針更有效地分離、捕獲細菌[67 - 69]，即使在復雜體系中也可以實現多種細菌的低濃度檢測[70]。

4 總結與展望

許多研究已表明SERS是一個強大的在線檢測病原菌的常規技術，通過合理構建標記和無標記SERS系統，可開發出新穎和可靠的病原菌檢測方法。盡管SERS技術得到了很好的發展，但實現真正量化分析仍然非常具有挑戰性。可以展望，通過提高SERS標簽的多重標記能力和生物相容性，探索高靈敏和高穩定性SERS基底的制備，以及建立基于標記和無標記SERS方法的標準操作程序，將使SERS技術成為一種細菌，特別是病原菌檢測的可靠常規技術。