QuEChERS-超高效液相色譜-串聯四極桿飛行時間質譜法同時測定果蔬中19種植物生長調節劑殘留

姚恬恬， 劉 翻， 金 鑫， 柳英霞， 萬益群,， 郭 嵐*,

(1.南昌大學化學學院，江西南昌 330031 2.南昌大學分析測試中心，江西南昌 330047)

植物生長調節劑(Plant Growth Regulators,PGRs)是一類用于調節植物生長發育的農藥[1]，它們可以增強作物的抗逆性，縮短蔬菜、水果的成熟期，提高產量及改善品質，被廣泛應用于現代農業生產。但植物生長調節劑與其他農藥一樣也具有一定的毒性[2]，如2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)具有急性神經毒性，對皮膚和眼睛有刺激作用，對肝腎有損害[3]；多效唑對雄性生殖器官有損傷，有可能是致癌物質[4 - 5]；丁酰肼的水解產物二甲基聯氨是一種潛在的致癌物等[6]。近年來，濫用及不當使用植物生長調節劑的現象時有發生，已影響到農產品的食用安全，對人民健康造成威脅。因此，開展果蔬中植物生長調節劑殘留的快速檢測新技術研究，對保證食品安全、促進國民健康及社會經濟發展都有十分重要的現實意義。

我國關于植物生長調節劑的多殘留檢測技術和有關限量標準的基礎研究還處于發展初期，多殘留同時檢測的國家標準尚未建立[7 - 8]。由于食品基質復雜，而植物生長調節劑種類繁多，化學結構和性質各異，且殘留水平較低，因此需要采用更有效地樣品前處理技術和更為靈敏的檢測方法來進行植物生長調節劑多殘留分析檢測。目前，植物生長調節劑殘留的檢測方法有酶聯免疫法(ELISA)[9]、毛細管電泳法(CE)[10]、離子色譜法(IC)[11]、氣相色譜-質譜法(GC-MS)[12]、高效液相色譜法(HPLC)[13]、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS/MS)[14 - 18]和液相色譜-串聯飛行時間質譜法(LC-Q -TOF-MS/MS)[19 - 20]。這些方法各具特色，ELISA法只能測定單一化合物，且假陽性高；CE法的靈敏度雖高，但重現性較差；GC-MS法分析植物生長調節劑，往往需要衍生，操作比較繁瑣，周期長；IC和HPLC法的靈敏度較低；LC-MS/MS法靈敏度高，專屬性好，是目前植物生長調節劑的主要分析方法。LC-Q-TOF/MS/MS法作為高分辨質譜技術的代表，在質量數精度、全質量數據采集、數據可溯源性和數據庫檢索等方面有著低分辨質譜無可比擬的優勢，已越來越多地應用于多農殘檢測領域[21 - 22]，但目前文獻報道涉及植物生長調節劑殘留分析的種類較少，難以滿足食品安全監測工作的需要。

QuEChERS方法具有快速、簡便、經濟、高效、穩定和可靠等特點，自2003年引入以來，被廣泛用作多殘留分析中的樣品制備技術[23 - 24]。本文采用QuEChERS法結合UPLC-Q-TOF-MS/MS技術，優化了樣品前處理方法以及色譜-質譜分析條件，考察了基質效應，建立了果蔬中19種植物生長調節劑殘留的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析方法。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

Triple TOFTM5600+四極桿飛行時間質譜儀(美國，AB SCIEX公司)；UPLC 30A高效液相色譜儀(日本，島津公司)；TGL-16G高速離心機(上海安亭科學儀器廠)；MS3渦旋混勻器(德國，IKA公司)；DSY-V氮吹濃縮儀(北京東方精華苑)；JJ-2組織搗碎勻漿機(常州國華儀器有限公司)；PULSE-Analytic超純水裝置(英國，ELGA公司)。

19種植物生長調節劑標準品：赤霉酸、脫落酸、吲哚丙酸、對氯苯氧乙酸、噻苯隆、4-碘苯氧基乙酸、調果酸、2，4-D、萘乙酸、氯吡脲、抗倒胺、環丙酸酰胺、吲哚乙酸、6-芐氨基嘌呤、吲哚丁酸、抗倒酯、多效唑、烯效唑、抑芽唑(純度≥99.0%，德國Dr.Ehrenstorfer公司)。標準溶液的配制：分別準確稱取10 mg各標準品于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，配制成1 mg/mL 的單標準儲備液，4 ℃保存。根據需要配制系列質量濃度的混合標準工作溶液。乙腈、甲醇(色譜純，德國默克公司)；甲酸(色譜純，美國TEDIA公司)；NH4Ac(色譜純，美國ACS公司)；HAc、NaCl、無水MgSO4均為分析純(上海國藥集團化學試劑有限公司)；吸附劑：C18、石墨化炭黑(GCB)和N-丙基乙二胺(PSA)均購自上海安譜公司。水為超純水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 樣品前處理

將果蔬樣品去皮后勻漿，準確稱取10 g勻漿后的樣品于50 mL聚丙烯離心管中，加入20 mL HAc-乙腈溶液(1∶99,V/V)，同時加入4 g無水MgSO4和1 g NaCl，3 000 r/min渦旋3 min，以4 000 r/min離心10 min。取10 mL上清液于50 mL離心管中，加入150 mg無水MgSO4和700 mg C18+25 mg GCB+50 mg PSA組合凈化劑，以3 000 r/min渦旋3 min，再以4 000 r/min離心10 min。取5 mL上清液于玻璃試管中，于40 ℃水浴中氮吹濃縮至近干，殘余物用1 mL甲醇超聲溶解后，過0.22 μm濾膜，供UPLC-Q-TOF-MS/MS分析。

1.3 色譜分離條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18柱(75×2.1 mm，2.0 μm)；流動相：A相為水(含5 mmol/L NH4Ac和0.1%甲酸)，B相為甲醇。梯度洗脫程序：0 min，5%B；3 min，60%B；16 min，70%B；16.1 min，80%B，保持2 min。流速：0.2 mL/min；柱溫：35 ℃；進樣量：5 μL。

1.4 質譜條件

離子源：ESI和APCI復合源；正負離子掃描方式；氣簾氣(CUR)30 psi；霧化氣(GAS 1)50 psi；輔助氣(GAS 2)50 psi；離子源溫度550 ℃。一級質譜：掃描范圍100～450 Da；數據采集時間100 ms；去簇電壓(DP)80 V；碰撞能(CE)10 V。二級質譜：掃描范圍40～450 Da。19種植物生長調節劑的定性、定量離子、噴霧電壓(ISVF)、去簇電壓(DP)和碰撞能(CE)詳見表1。

表1 19種植物生長調節劑的質譜優化參數和保留時間

(續表1)

No.PGRsRetentiontime(min)Ion modePrecursor ionTheoretical(m/z)Found(m/z)Relativedeviation(10-6)Productions(m/z)ISVF(V)DP(V)CE(V)44-Chlorophenoxyacetic acid6.91-185.0011185.00110.2126.9979*4 50016205Thidiazuron7.13-219.0346219.03491.499.9992*70.98414 500142064-Iodophenoxyacetic acid7.62-276.9367276.93690.8218.9354?126.90654 50019307Cloprop7.87-199.0167199.0165-0.8126.9983*4 500162082,4-Dichlorophenoxyacetic acid8.00-218.9621218.96220.4160.9600*4 50015259Naphthylacetic acid8.04-185.0608185.0607-0.5141.0730*4 500121510Forchlorfenuron8.63-246.0440246.0439-0.4127.0095*91.03154 500151511Inabenfide9.86-337.0749337.0748-0.5231.0381122.0275*4 5002411512Cyclanilide11.78-271.9887271.98901.5229.0039159.9762*4 500213013Indole-3-acetic acid6.25+176.0706176.0705-0.4130.0783*5 5008018146-Benzyladenine6.56+226.1087226.10901.391.0634*65.04445 50010033153-Indolebutyric acid7.39+204.1019204.1017-0.8186.1111*168.08335 500852216Trinexapac-ethyl8.84+253.1071253.10710.2207.086969.0403*5 500902017Paclobutrazol10.40+294.1368294.13690.4125.027570.0471*5 500853318Uniconazole13.03+292.1211292.12120.3125.027170.0466*5 5001152619Triapenthenol13.41+264.2070264.20720.8109.111570.0471*5 5008035

*quantitative product ion.

2 結果與討論

2.1 色譜分離條件的選擇

分別以甲醇-5 mmol/L NH4Ac水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液和甲醇-5 mmol/L NH4Ac-0.1%甲酸水溶液為流動相，考察三者對19種待測物峰形、離子化效率及分離度的影響。結果表明，以甲醇-5 mmol/L NH4Ac-0.1%甲酸水溶液為流動相，采用梯度洗脫，19種植物生長調節劑靈敏度較高，且分離度和峰形都比較好。19種植物生長調節劑的MRM色譜圖見圖1。

圖1 19種植物生長調節劑MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the 19 PGRs mixed standard solution1.Gibberellic acid(0.25 mg/L);2.Abscisic acid(0.25 mg/L);3.3-Indolepropionic acid(1.25 mg/L);4.4-Chlorophenoxyacetic acid(0.25 mg/L);5.Thidiazuron(0.05 mg/L);6.4-Iodophenoxyacetic acid(0.25 mg/L);7.Cloprop(0.2 mg/L);8.2,4-Dichlorophenoxyacetic acid(0.25 mg/L);9.Naphthylacetic acid(1.25 mg/L);10.Forchlorfenuron(0.05 mg/L);11.Inabenfide(0.05 mg/L);12.Cyclanilide(0.2 mg/L);13.Indole-3-acetic acid(0.25 mg/L);14.6-Benzyladenine(0.2 mg/L);15.3-Indolebutyric acid(0.25 mg/L);16.Trinexapac-ethyl(0.25 mg/L);17.Paclobutrazol(0.25 mg/L);18.Uniconazole(1.25 mg/L);19.Triapenthenol(0.25 mg/L).Note:1-12 were in negative mode,13-19 were in positive mode.

2.2 質譜條件的優化

圖2 不同提取溶劑對19種植物生長調節劑的提取效率(n=3)Fig.2 Extraction efficientcy of the 19 PGRs with different extraction solvents(n=3)a.acetonitrile;b.acetic acid-acetonitrile(1∶99,V/V);c.methanol-acetonitrile(1∶1,V/V);d.acetic acid-methanol-acetonitrile(1∶50:49,V/V).1-19:the numbers are consistent with Fig.1.

分別在正、負離子模式下進行全掃描，掃描范圍m/z40～400，得到19種植物生長調節劑的一級質譜圖。對比正、負離子兩種模式下的響應強度，為19種化合物分別確定其合適的離子模式，以達到最高的電離效率。選擇準分子離子為母離子，在10～120 V的范圍內分別優化其去簇電壓(DP)，以獲得最強的母離子信號。在此基礎上對各個物質進行二級質譜掃描，得到碎片離子信息，選擇豐度相對較高和相對分子質量較大的碎片離子作為定量離子和定性離子，優化碰撞能(CE)，建立多反應監測(MRM)模式。優化后的Q-TOF-MS/MS參數如表1所示。

2.3 提取溶劑的選擇

比較了乙腈、HAc-乙腈溶液(1∶99,V/V)、甲醇-乙腈溶液(1∶1,V/V)、HAc-甲醇-乙腈溶液(1∶50∶49,V/V)4種提取溶劑對19種植物生長調節劑的提取效果，結果見圖2。實驗結果表明，采用HAc-乙腈(1∶99,V/V)為提取溶劑，19種植物生長調節劑的回收率在75%～105%之間，優于其他3種提取溶劑。而且對于吲哚乙酸、吲哚丁酸、吲哚丙酸、調果酸、赤霉酸等酸性物質，添加了1%HAc的提取溶劑的提取效率明顯提高。這是由于酸性條件下抑制了羧基的電離，從而增加了酸性物質在有機溶劑中的溶解度。另外，實驗還發現使用乙腈作為提取溶劑時，共提物明顯比用甲醇作提取溶劑的少，因此本實驗最終選擇HAc-乙腈(1∶99,V/V)為提取溶劑。

2.4 凈化條件的優化

圖3 19種植物生長調節劑在不同凈化劑組合中的回收率(n=3)Fig.3 Recoveries of the 19 PGRs with different purification agent combinations(n=3) 1-19:the numbers are consistent with Fig.1.

與傳統的固相萃取方法不同，QuEChERS法采用適當的吸附劑，通過非極性相互作用、極性相互作用、離子相互作用等選擇性保留基質中雜質組分，從而達到凈化的效果。果蔬基質的共提物主要包括色素、糖類和有機酸等，常用C18、PSA和GCB進行凈化[25]。在3種吸附劑中，PSA是一種弱陰離子交換劑，能有效消除提取物中脂肪酸和有機酸的干擾，但對分子結構中含羧基的化合物也有一定的吸附作用；GCB可有效去除色素；C18對非極性物質有很強的吸附作用。實驗結果表明，GCB對色素的凈化效果最好，其次是PSA，但兩者對一些目標化合物有吸附作用，平均加標回收率分別為61.8%和80.6%；而C18能明顯減少提取物中基質，而且幾乎不吸附目標化合物，平均回收率為105%，但去除色素效果并不明顯。因此實驗以C18為主要凈化劑，加入適量的GCB和PSA，以提高凈化效果，同時對目標化合物吸附量最少。選擇40 μg/L的加標濃度，考察了(a)800 mg C18+25 mg GCB、(b)700 mg C18+25 mg GCB+50 mg PSA和(c)500 mg C18+25 mg GCB+100 mg PSA 3種條件下的凈化效果和加標回收率，結果見圖3。其中采用700 mg C18+25 mg GCB+50 mg PSA為凈化劑時，19種目標化合物的回收率在75%～118%之間，而且去除色素等基質的效果較好，因此最終選擇組合(b)為本實驗的凈化劑。

2.5 基質效應、線性范圍、檢出限和定量限

在質譜分析技術中，基質效應是一個常見干擾因子，指樣品共提物的基質會影響目標物的離子化，造成目標物在質譜上的響應發生增強或抑制的現象。對其進行合理的評價，并采取適當的方法減少或消除，可以提高測定準確度。文獻報道多采用基質匹配校準方法[26 - 27]和同位素內標定量方法[28]，而前者更為經濟。本文采用相對響應值法(基質效應=空白基質標準響應值/純溶劑標準響應值)評價了19種植物生長調節劑在不同果蔬中的基質效應，同時還比較了目標物在基質和純溶劑中保留時間的差異，見表2。實驗結果顯示，19種化合物在純溶劑和基質中的保留時間偏差小于2%，基質效應系數超過0.80～1.20范圍的目標物數目在橙、葡萄、黃瓜中分別為9、9和1，表明果蔬中的基質效應不可忽略。本實驗最終采用空白基質配制標準工作溶液，在優化的色譜和質譜條件下進行分析，以峰面積(Y)對濃度(c)繪制基質校準曲線，并計算其檢出限和定量限，見表2。結果表明，19種化合物線性關系良好，其檢出限和定量限遠低于各國現行殘留限量標準，可用于實際樣品檢測。

表2 19種植物生長調節劑的基質效應、在基質與純溶劑中的保留時間偏差、在基質中的線性關系、檢出限和定量限

(續表2)

PGRs No.?SampleLinear equationLinear range(μg/L)Retention timedeviation(%)Matrix effectR2LODs(μg/kg)LOQs(μg/kg)18Orangey=2.07×102c-63410-50001.230.99990.51.7Cucumbery=5.41×102c-3885-5000.0740.931.00000.290.98Grapey=6.02×102c-8305-5000.380.990.99980.040.1419Orangey=4.15×103c-202055-500-0.700.550.99930.040.11Cucumbery=8.34×103c-186265-5000.0961.010.99960.070.23Grapey=1.16×104c-251885-5000.301.280.99990.080.27

*:the numbers are consistent with Fig.1.

2.6 加標回收率和精密度

為了進一步評估該方法的準確度和精密度，對橙、黃瓜和葡萄分別進行了加標回收實驗。每種化合物添加3個濃度水平，每個水平做6個平行樣品，然后按1.2進行樣品前處理，在1.3和1.4的色譜和質譜條件下，基質標準溶液外標法測定，平均回收率和相對標準偏差(RSD)見表3。19種植物生長調節劑在3個添加水平的平均回收率在70.1%～116.2%之間，RSD小于10.6%，表明方法具有良好的準確度和精密度。

表3 橙子、黃瓜和葡萄中19種植物生長調節劑的加標回收結果(n=6)

(續表3)

PGRs No.?Spiked level(μg/kg)OrangeCucumberGrapeRecovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)Recovery(%)RSD(%)141073.92.473.75.071.53.15074.93.287.55.071.46.910076.13.475.12.482.85.7151092.15.689.16.496.43.45080.04.193.33.588.84.110088.41.995.53.3100.63.91610115.23.396.44.684.44.35084.35.380.02.691.43.710085.77.292.42.689.15.0171090.15.090.64.6102.13.550112.12.884.58.9109.53.510089.55.695.33.4101.24.0181081.17.895.66.395.73.850109.62.890.85.598.44.810083.62.795.22.1104.83.9191082.05.997.85.582.93.85080.93.393.53.290.03.210076.81.9113.52.7105.05.3

*:the numbers are consistent with Fig.1.

圖4 葡萄樣品的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of grape sample

2.7 樣品的測定

應用所建立的分析方法對南昌市售的15批橙、黃瓜和葡萄樣品進行分析，樣品的MRM色譜圖見圖4。在15批樣品中檢測到7種植物生長調節劑：赤霉酸、噻苯隆、氯吡脲、吲哚乙酸、多效唑、烯效唑和脫落酸，其中前6種含量在0.14～13 μg/kg之間，而脫落酸在10批樣品中均有檢出，含量在6.7～415.4 μg/kg范圍內。

3 結論

建立了果蔬樣品中19種植物生長調節劑的UPLC-Q-TOF-MS/MS分析方法。樣品采用QuEChERS前處理技術，經酸化乙腈提取，C18、PSA和GCB聯合凈化，利用保留時間和高分辨質譜獲得的母離子與子離子的精確質量數對化合物進行定性；MRM模式監測，基質標準溶液外標法進行定量。本方法簡單快速、靈敏度高，準確度和精密度都滿足方法學指標，可用于果蔬中19種植物生長調節劑的殘留分析。