生鮮豬肉中吡哌酸殘留的共振光散射檢測研究

劉 艷， 李莉娟， 肖雙宏， 陳明媛， 江 虹

(長江師范學院化學化工學院，長江師范學院武陵山片區綠色發展協同創新中心，重慶 408100)

吡哌酸(Pipemidic Acid，PPA)是一種喹諾酮類廣譜抗菌藥，是人、畜共用藥物。該藥在臨床上主要用于治療由敏感革蘭陰性桿菌和葡萄球菌所致的尿道炎、膀胱炎、菌痢、腸炎、中耳炎等，在畜禽動物上已廣泛作為預防和治療用藥，由此可能造成該藥在動物源性食品中的殘留，當人食用時，可通過食物鏈在人體內不斷畜積，一旦畜積到一定程度，就會對人體產生毒性，從而影響人體健康。因此，對動物源性食品中吡哌酸殘留進行研究有一定意義。

目前，國內外檢測吡哌酸含量的方法主要有紫外分光光度法[1]、高效液相色譜法[2 - 6]、液-質聯用法[7 - 11]和電化學法[12 - 13]等方法。但這些方法中，要么儀器較貴不易普及，要么前處理復雜，或條件要求苛刻或選擇性欠佳等，故研究簡便、易行的高靈敏分析方法很有必要。本工作以三苯甲烷類堿性染料亮綠(Brilliant Green,BLG)作探針，用普通熒光光譜儀及具有高靈敏的瑞利光散射技術研究生鮮豬肉中吡哌酸殘留。本工作尚未見文獻報道。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-2500型熒光分光光度計(日本，日立公司)；pHS-3C型精密酸度計(上海虹益儀器儀表有限公司)。

吡哌酸(PPA)(中國食品藥品檢定研究院，對照品批號：100151-201103)標準溶液：準確稱取吡哌酸對照品適量，用0.010 mol/L HCl溶解后用水定容，配成303.3 mg/L標準貯備液，冰箱4 ℃保存，操作液濃度為3.033 mg/L。亮綠(BLG)(天津市光復精細化工研究所)溶液：1.0×10-4mol/L。Tris溶液：0.20 mol/L。HCl：0.10 mol/L。Tris-HCl緩沖溶液：用適量HCl和適量Tris溶液混合，用pH計測定，配成pH=3.0～9.6的溶液。水為二次蒸餾水。

市售生鮮豬肉(1#和2#)。

1.2 樣品處理

取適量1#和2#豬肉樣品，洗凈后切塊并攪成肉末。分別稱取肉末15 g左右(稱準至0.000 1 g)，加10 mL 0.010 mol/L HCl，使吡哌酸充分溶出，攪勻后超聲提取約40 min，再以4 000 r/min離心20 min，上清液轉入燒杯中。按上述方法重復提取一次，合并兩次上清液，加1∶1甲醇溶液40 mL，超聲提取30 min，再以4 000 r/min離心20 min，上清液置于小燒杯中，在100 ℃水浴中濃縮至約2 mL。各樣品平行處理5份。

1.3 實驗方法

精密移取2.50 mL pH=9.56的Tris-HCl緩沖溶液于10 mL 具塞比色管中，再依次加入2.50 mL 1.00×10-4mol/L亮綠溶液和適量3.033 mg/L吡哌酸標準溶液，搖勻后用水稀至刻度，再搖勻，15 min后，在熒光分光光度計上，以測定狹縫5.0 nm，λex=λem=220 nm，掃描共振光散射(RLS)光譜，記錄波長370 nm處該體系及試劑空白的RLS強度IRLS及I0，計算ΔIRLS=IRLS-I0。

2 結果與討論

2.1 共振光散射光譜

圖1 亮綠-吡哌酸的共振光散射光譜Fig.1 RLS spectra of brilliant green and pipemidic acid1.0.303 mg/L PPA;2.2.50×10-5 mol/L BLG;3-8.0.0,0.0607,0.121,0.182,0.243,0.303 mg/L PPA-2.50×10-5 mol/L BLG,pH=9.56.

從圖1可見，單獨的吡哌酸溶液的RLS十分微弱，亮綠溶液的RLS也較微弱，而亮綠在堿性環境(pH=9.56)中，其RLS強度顯著增強，最大RLS峰位于370 nm。當在亮綠的堿性溶液中加入吡哌酸標準溶液后，由于亮綠是一種堿性陽離子染料，在溶液中以陽離子形式存在，吡哌酸結構上含有羧酸根離子，在溶液中以陰離子形式存在，于是二者以靜電引力結合生成二元離子締合物，其摩爾質量增大，導致RLS明顯增強。從曲線3～8可知，隨著吡哌酸濃度的逐漸增大，體系的RLS強度隨之增強。當吡哌酸濃度在0.303 mg/L以內時，其質量濃度與體系的RLS增強強度(ΔIRLS)呈線性關系，故該方法可用于吡哌酸的定量分析。

2.2 適宜反應條件

2.2.1 介質、酸度及用量的影響考察了HAc-NaAc、B-R、Tris-HCl、NaOH溶液對體系IRLS的影響。結果表明，使用Tris-HCl溶液作反應介質時，RLS相對較強，ΔIRLS較大(ΔIRLS=412)，故選擇用Tris-HCl作反應介質。繼而考察了酸度對體系IRLS的影響，結果見圖2。實驗表明，體系在酸性范圍內受酸度影響較小，在堿性范圍內受酸度影響很大，可見最適酸度為pH=9.56，體系的ΔIRLS最大(ΔIRLS=425))，靈敏度最高。隨即考察了其用量對體系IRLS的影響，結果表明當pH=9.56 Tris-HCl溶液用量為2.50 mL時，RLS相對最強，ΔIRLS最大(ΔIRLS=446)，靈敏度最高。實驗選擇用2.50 mL pH=9.56 Tris-HCl溶液來控制體系的酸度。

2.2.2 亮綠溶液濃度的影響考察了5.00×10-6～4.00×10-5mol/L范圍內亮綠濃度對體系IRLS影響，結果見圖3。結果表明，亮綠在2.20×10-5～2.80×10-5mol/L范圍內，最佳濃度為2.50×10-5mol/L。當亮綠濃度大于或小于最佳值時，體系的ΔIRLS均有不同程度降低，降低原因要么是亮綠用量不足，使締合反應不完全，要么是亮綠過量太多，自身聚集作用增強，均導致體系ΔIRLS降低，靈敏度降低。實驗選擇用2.50 mL 1.00×10-4mol/L亮綠溶液。

圖2 pH值對ΔIRLS的影響Fig.2 Effect of buffer pH on ΔIRLSPPA:0.303 mg/L;BLG:2.00×10-5 mol/L.

圖3 亮綠濃度對ΔIRLS的影響Fig.3 Effect of BLG concentration on ΔIRLSPPA:0.303 mg/L;pH=9.56.

2.2.3 試劑加入順序的影響考察了吡哌酸、亮綠及Tris-HCl不同加入順序對體系IRLS強度的影響。結果表明，加入順序為吡哌酸、亮綠、Tris-HCl時，ΔIRLS=480；加入順序為Tris-HCl、亮綠、吡哌酸時，ΔIRLS=495；加入順序為吡哌酸、Tris-HCl、亮綠時，ΔIRLS=483。可見，最佳加入順序為Tris-HCl、亮綠、吡哌酸。實驗按最佳加入順序進行。

2.2.4 反應時間的影響考察了締合反應時間對體系IRLS強度的影響。結果表明，開始時隨著締合反應的進行，體系ΔIRLS逐漸增大，當達15 min時，ΔIRLS最大(ΔIRLS=506)，15 min后至120 min內，ΔIRLS不再增大，基本處于穩定狀態。實驗選在15 min后測定。

2.3 吡哌酸濃度與ΔIRLS的關系

分別取3.033 mg/L吡哌酸標準溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL 于10 mL比色管中，按實驗方法加入其它試劑溶液，掃描RLS光譜。以吡哌酸質量濃度為橫坐標，ΔIRLS為縱坐標作標準曲線。線性回歸方程為：ΔIRLS=2.191+1646c，相關系數r=0.9997。該體系的線性范圍為0.007～0.30 mg/L，檢出限為0.0063 mg/L，定量限為0.014 mg/kg。

2.4 共存物質的影響

2.5 樣品分析

取已處理的豬肉樣品1#和2#濃縮液，按實驗方法，用共振光散射技術于370 nm處檢測樣品溶液中吡哌酸的含量。同時，以空白豬肉樣為樣品，進行3個不同加標濃度的回收試驗(n=5)。結果見表1。最后將測定結果與國家標準方法(UV法)對照，再判斷方法的準確度和精密度(RSD)。

表1 樣品分析結果及回收試驗(n=5)

ND:notdetected.

3 結論

依據亮綠與吡哌酸的締合反應，用RLS技術檢測生鮮豬肉中的吡哌酸藥物殘留，方法具有高的靈敏度和選擇性，較高的準確度和精密度。測定結果與國家標準方法一致，但靈敏度高于國家標準方法(RLS法比UV法高4個數量級)。該方法簡便、快速，樣品處理安全、所用儀器易于普及。該法適于生鮮豬肉中吡哌酸的殘留分析。