基于陽離子表面活性劑/核酸適配體的超分子組裝體熒光檢測Hg(Ⅱ)的研究

高 菲， 賈 蘭， 陳 松

(太原理工大學材料學院，山西太原 030024)

汞是在生態系統中唯一能完善循環的重金屬。汞具有高遷移、不可降解及生物富集性等特性，因此微量的汞也會對生態環境造成嚴重的危害[1]。汞與其化合物可通過人體的皮膚、消化道或者呼吸道進入人體，對口、粘膜和牙齒都有不良影響，嚴重破壞人體的中樞神經系統，長時間暴露在高汞環境中甚至可以導致腦損傷及死亡[2]。汞以多種形式存在于環境中，水環境中的Hg(Ⅱ)是最常見的形式，而汞中毒一般也由Hg(Ⅱ)引起，Hg(Ⅱ)會與人體中的巰基絡合形成金屬蛋白，抑制酶的活性，損害人體的肝功能，從而導致腎衰竭。因此，檢測生物體及水環境中微量Hg(Ⅱ)成為近年來的重要研究領域[3 - 4]。核酸適配體是一段脫氧核糖核酸(DNA)或者核糖核酸(RNA)序列，它是利用體外篩選技術(SELEX)[5]從核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段。核酸適配體可以與目標物高選擇性、高特異性結合。研究發現，Hg(Ⅱ)能夠與堿基胸腺嘧啶T特異性結合，形成穩定的“T-Hg(Ⅱ)-T”發夾狀結構，基于這種結構的檢測體系已有報道[6 - 9]。表面活性劑中加入帶相反電荷的聚電解質，在低于表面活性劑的臨界膠束濃度(CMC)條件下，可通過靜電作用和疏水作用形成類膠束組裝體[10]。

熒光光譜法具有簡便快捷、高靈敏度和高選擇性、實時監測以及成本低等優點[11]。本研究利用帶正電的陽離子表面活性劑十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)與帶負電的Hg(Ⅱ)核酸適配體，通過靜電和疏水作用結合為組裝體。當加入Hg(Ⅱ)后，Hg(Ⅱ)能夠與堿基胸腺嘧啶T特異性結合，形成穩定的“T-Hg(Ⅱ)-T”發夾狀結構，將會誘導其解組裝。利用尼羅紅在水環境與疏水腔中不同熒光強度的性質構造“熒光關”的Hg(Ⅱ) 的檢測體系。圖1為其檢測Hg(Ⅱ)的原理示意圖。

圖1 DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅組裝與加入Hg(Ⅱ)后解組裝示意圖Fig.1 Scheme of the DTAB/Hg(Ⅱ) Aptamer/NR assembly and Hg(Ⅱ) induced disassembly

1 實驗部分

1.1 主要儀器及試劑

FLUOROMAX-4熒光光譜儀(美國，HORIBA);JFM-1011透射電鏡(TEM)(日本，JEOL)；JK99B全自動張力儀(上海中晨數字技術設備有限公司)；SB-100D超聲波清洗機(寧波新芝生物科技股份有限公司)；H/T16MM臺式高速離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司)。

十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)(99%，阿拉丁試劑(上海)有限公司)；Hg(Ⅱ)核酸適配體(5′-TTCTTTCTTCCCTTGTTTGTT-3′)(HAP純化，生工生物工程(上海)股份有限公司)；高氯酸汞(99%+，Strem Chemicals,Inc.美國)；尼羅紅(NR)(≥95%，阿拉丁試劑(上海)有限公司)。實驗用水由XYA2-50-H純水機制備。

1.2 實驗方法

1.2.1 DTAB臨界膠束濃度的確定配制濃度為1.0×10-4mol·L-1尼羅紅的丙酮溶液，同時配制濃度1.0×10-5～1.0 mol·L-1的系列DTAB溶液，各取2 mL于離心管中，分別加入20 μL的1.0×10-4mol·L-1尼羅紅的丙酮溶液(尼羅紅終濃度為1.0×10-6mol·L-1)。渦旋振蕩混勻后，將含有尼羅紅的DTAB溶液敞口超聲處理30 min，靜置1 h，測量熒光發射光譜。

1.2.2 Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度的確定配制濃度為1.0×10-3～10 μmol·L-1的系列Hg(Ⅱ)核酸適配體溶液，分別加入一定量的DTAB溶液(DTAB終濃度為5.0×10-4mol·L-1)，各取2 mL置于離心管中，分別加入20 μL的1.0×10-4mol·L-1尼羅紅的丙酮溶液，混勻，敞口超聲處理后，進行熒光光譜測量。

1.2.3 超分子組裝體的表征熒光光譜在FLUOROMAX-4(HORIBA，美國)熒光光譜儀上測試。測試條件：電壓750 V，固定激發波長為545 nm，測定發射波長范圍為565～800 nm，狹縫寬度為10/10 nm。

透射電鏡(TEM)測試在JEM-1011(JEOL，JAPAN)透射電子顯微鏡上進行，電流加速電壓為80 kV。制樣時，對樣品進行負染色，用微量注射器將溶液懸滴到銅網上靜置數分鐘，然后用磷鎢酸鈉染色液浸泡數分鐘，再用濾紙吸去多余的液體，待干后用于電鏡觀察。

表面張力是在JK99B(鉑金板法)全自動張力儀(上海中晨數字技術設備有限公司)上進行測定。

2 結果與討論

2.1 DTAB的臨界膠束濃度

本實驗采用熒光譜法[12]測定DTAB的CMC值。圖2為發射波長為638 nm時，DTAB/尼羅紅溶液體系中DTAB濃度對數的熒光光譜圖，可以看出當DTAB的濃度低于某一值時，體系的熒光強度基本無變化，隨著DTAB的濃度增加，體系的熒光強度逐漸增強，并產生一個拐點，在拐點處做兩條切線，切線位置對應濃度即為DTAB的CMC值，用熒光法測得的CMC值為9.2 mmol·L-1。

2.2 Hg(Ⅱ)核酸適配體的最佳濃度

Hg(Ⅱ)核酸適配體是通過SELEX從核酸分子文庫中得到的寡核苷酸片段。圖3是發射波長在638 nm處，在DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液體系中Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度的熒光強度。可以看出當Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度很小時，體系熒光強度基本保持不變，這是因為Hg(Ⅱ)核酸適配體的濃度過小，不足以與DTAB形成組裝體；當Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度超過0.1 μmol·L-1時，體系的熒光強度開始增強，此時體系中帶正電的表面活性劑DTAB與帶負電的Hg(Ⅱ)核酸適配體通過靜電與疏水作用結合，形成超分子組裝體，熒光探針尼羅紅進入組裝體的疏水腔中，從而產生熒光強度的變化；而當Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度大于5 μmol·L-1時，體系熒光強度增長趨于平緩，此時DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅超分子組裝體基本完全形成。為了保障后續實驗中形成DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅超分子組裝體，實驗選用的Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度為5.0 μmol·L-1。組裝體中DTAB濃度為5.0×10-4mol·L-1，尼羅紅的濃度為1.0×10-6mol·L-1。

圖2 DTAB/尼羅紅溶液中DTAB濃度對數的熒光強度Fig.2 Fluorescence intensity of the logarithm concentration of DTAB in DTAB/NR solutions

圖3 DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液體系中Hg(Ⅱ)核酸適配體濃度的熒光強度Fig.3 Fluorescence intensity of Hg(Ⅱ) aptamer concentration in the DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions

2.3 超分子組裝體的表征

為了觀察DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液形成的組裝體，以及加入Hg(Ⅱ) 后組裝體解離，分別對其用透射電鏡(TEM)進行表征。圖4(a)為DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液的TEM；圖4(b)為加入1.0×10-4mol·L-1Hg(Ⅱ)的DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液的TEM。可以看出，圖4(a)中存在較為規則且分布均勻的圓形膠束，在加入Hg(Ⅱ)后(圖4(b))基本不存在膠束。說明DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅組裝體已經完全解體。

圖4 (a)DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液的透射電鏡(TEM)圖；(b)DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液中加入1.0×10-4 mol·L-1Hg(Ⅱ)的TEM圖Fig.4 (a)TEM image of DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions;(b)TEM image of DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions with 1.0×10-4 mol·L-1 Hg(Ⅱ)

圖5 (a)不同濃度Hg(Ⅱ)在DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液中的熒光光譜圖；(b)熒光猝滅效率與加入Hg(Ⅱ) 濃度的關系(插圖對應的是線性檢測圖)Fig.5 (a)Fluorescence spectra of different concentration of Hg(Ⅱ) in the DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions;(b)Quenching efficiency of assemblies in the DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions(The inset corresponds to the linear plots of the detection)

2.4 Hg(Ⅱ)的檢出限

圖5(a)為在DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液體系中，加入不同濃度Hg(Ⅱ)的熒光光譜圖。隨著Hg(Ⅱ)濃度的增加，體系的熒光強度逐漸變小，其熒光猝滅率((I0-I)/I0)與Hg(Ⅱ)濃度呈良好線性關系(圖5(b))。這是因為Hg(Ⅱ)能夠與核酸適配體中堿基胸腺嘧啶T特異性結合，形成穩定的“T-Hg(Ⅱ)-T”發夾狀結構，會將Hg(Ⅱ)從組裝體中解離出來，從而使組裝體解組裝，熒光探針尼羅紅會被釋放出來，從而使體系的熒光強度降低。方法的線性檢測范圍為1.0×10-11～1.0×10-10mol·L-1，計算可以得到Hg(Ⅱ)檢出限為5.1×10-12mol·L-1。

2.5 Hg(Ⅱ)的選擇性分析

圖6 DTAB/Hg2+核酸適配體/尼羅紅溶液中不同離子的熒光猝滅效率圖Fig.6 Quenching efficiency of DTAB/Hg(Ⅱ) aptamer/NR solutions with different ions

為了驗證組裝體系對Hg(Ⅱ)的選擇性，選取了K+、Na+、Ag+、Ni2+、Ca2+、Fe3+、Mn2+、Ba2+、Fe2+、Pb2+、Mg2+、Cu2+、Cd2+作為對照離子。圖6中為加入不同離子時，對DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅溶液在638 nm處熒光強度的猝滅效率，其中每種離子的濃度均為1.0×10-4mol·L-1。在DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅組裝體系中加入Hg(Ⅱ)時，熒光猝滅率可達60%。而加入其他離子時熒光強度僅下降或上升約2%～12%左右，與加入Hg(Ⅱ) 相比，其他離子對于檢測體系的影響可忽略不計。說明該DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅檢測體系對Hg(Ⅱ)具有良好的選擇性。

2.6 Hg(Ⅱ)在實際水樣中的檢測

為驗證所構建體系實際檢測能力，采用加標回收實驗[3,7,9]。用自來水作為實際水樣，配制DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅的檢測溶液。滴加Hg(Ⅱ)標準溶液，濃度分別為5.0×10-11mol·L-1和1.0×10-10mol·L-1，在最優實驗條件下，測定各溶液的熒光強度，根據線性方程計算出Hg(Ⅱ)的含量，計算得回收率為92%～107%，且相對標準偏差(RSD)在5%以內。

表1 實際水樣中Hg(Ⅱ)的檢測(n=3)

3 結論

利用帶正電的表面活性劑DTAB與帶負電的Hg(Ⅱ)核酸適配體通過靜電與疏水作用組裝，包埋熒光探針尼羅紅，構建DTAB/Hg(Ⅱ)核酸適配體/尼羅紅的“熒光關”檢測Hg(Ⅱ)的檢測體系。向該檢測體系添加Hg(Ⅱ)的濃度為1.0×10-4mol·L-1時，熒光猝滅率達60%。檢出限為5.1×10-12mol·L-1，線性檢測范圍為1.0×10-11～1.0×10-10mol·L-1。檢測體系對Hg(Ⅱ)具有良好的選擇性，且該方法可用于自來水中Hg(Ⅱ)的檢測，回收率為92%～107%。