在線固相萃取-氣相色譜/質譜法測定卷煙主流煙氣中煙草特有亞硝胺

劉 欣， 梁夢潔， 張承明， 王 晉， 黃海濤， 陳建華，李雪梅， 孔維松， 楊葉昆， 許 永， 楊光宇， 李 晶*

(1.云南中煙工業有限責任公司技術中心，云南昆明 650106；2.昆明醫科大學藥學院暨云南省天然藥物藥理重點實驗室，云南昆明 650500)

煙草特有亞硝胺(Tobacco Specific N-nitrosamines，TSNAs)是由煙草內源性生物堿與硝酸鹽及亞硝酸鹽通過亞硝化作用產生的一類具有致癌性化合物，它是卷煙煙氣中可能誘發癌癥的主要活性成分之一。目前研究較多的4種TSNAs主要是：N-亞硝基降煙堿(NNN)、4-(N-甲基亞硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亞硝基新煙草堿(NAT)和N-亞硝基假木賊堿(NAB)[1 - 2]。其中，國際癌癥組織(IRAC)已將NNK與NNN列為I類人體致癌物[2]，我國煙草行業也將NNK列為7種主要有害成分之一[3]。由于TSNAs在卷煙煙氣中的釋放量水平一般在納克/支，而煙氣基質又十分復雜，想要對卷煙主流煙氣中的TSNAs含量進行準確定量分析較為困難。因此，準確、快速的測定卷煙煙氣中TSNAs的含量對提高卷煙產品的吸食安全性以及吸煙對健康的危害研究均具有重要的現實意義。

目前，關于TSNAs的檢測方法主要有氣相色譜-熱能分析儀法(GC-TEA)[4 - 5]、氣相色譜-質譜聯用法(GC/MS)[6 - 8]和液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)聯用法[9 - 11]等。其中，由于TEA是專一性的檢測器，對TSNAs具有較好的選擇性，因此GC-TEA法應用最為廣泛，但是該方法靈敏度較低，分析時間過長；LC-MS/MS法的靈敏度和選擇性均高于GC-TEA法，但其儀器維護成本高，且噪音偏高；而GC/MS法由于其卓越的色譜分離能力，已逐漸成為測定卷煙主流煙氣中TSNAs的常用方法，但由于煙氣樣品基質復雜，在測定TSNAs前需要進行柱層析或固相萃取凈化操作，樣品前處理過程十分繁雜費時。針對上述方法在測定TSNAs中存在的不足，本研究建立了一種簡單、快速的測定卷煙主流煙氣中TSNAs含量的GC/MS法，具體是在凝膠凈化-氣相色譜聯用儀中將堿性氧化鋁固相萃取柱替代凝膠凈化柱，通過大體積進樣將樣品富集在固相萃取柱上，再用洗脫液進行反向洗脫，此時就可以將富集的TSNAs洗脫下來，待排干溶劑后再進行氣相色譜/質譜分析。在本文改進的方法中，樣品的固相萃取凈化可在線完成，萃取溶液可直接進樣分析，前處理過程十分簡單、方便，且進樣體積大幅度增加，檢測靈敏度相比常規方法大幅提高。該方法旨在為分析卷煙煙氣中TSNAs的含量提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器及試劑

QP 2010 Plus在線GPC(LC-20AD)-GC/MS聯用儀(日本，Shimadzu公司)；SM450直線型吸煙機(英國，CERULEAN公司)；YQ-1001C型超聲波清洗機(上海易凈超聲波清洗設備廠)；AE240電子分析天平(感量0.1 mg，瑞士Mettler公司)；球形氧化鋁(10 mm×2.0 mm，3～5 μm，德國Mecker公司)，通過勻漿法裝填制成在線固相萃取柱。

標準品：NNK、NNN、NAT、NAB(純度均≥98%，加拿大TRC公司)；內標物：NNK-d4、NNN-d4、NAT-d4、NAB-d4(純度均≥99%，加拿大TRC公司)；二氯甲烷、甲醇(均為色譜純，美國Fisher公司)。

1.2 實驗方法

圖1 在線固相萃取-氣相色譜/質譜檢測系統結構示意圖Fig.1 Schematic diagram of on-line SPE and GC/MS system

1.2.1 在線固相萃取-氣相色譜/質譜法檢測系統在線固相萃取-氣相色譜/質譜檢測系統結構示意圖如圖1所示：整個系統主要由閥A、閥B、固相萃取柱、泵A、泵B和GC-MS分析系統組成，泵A主要負責輸送流動相A，泵B主要負責輸送流動相B，固相萃取柱為堿性氧化鋁在線固相萃取柱(10 mm×2.0 mm，3～5 μm，理論萃取容量為5 mg)；流動相A：二氯甲烷；流速：0.2 mL/min；流動相B：二氯甲烷-甲醇(92∶8)；流速：0.2 mL/min。

閥切換及操作過程：(1)樣品富集及凈化：色譜進樣后(進樣量200 mL)，流動相A通過泵A推動樣品進入固相萃取柱進行富集，由閥A的1口進入，2口流出，2口與4口之間連接有固相萃取柱，流向為：1→2→4，經閥A的3口進入閥B的3口，最后從閥B的5口排入廢液。(2)樣品洗脫：切換閥A，流動相B通過泵B反向洗脫固相萃取柱，并進行溶劑切割，具體由閥A的5口進入，4口流出，流向為：5→4→2，經閥A的3口進入閥B的3口，前0.3 min(死體積)的流出液均通過閥B的5口排入廢液，通過閥B控制切割隨后0.6 min(切割體積120 μL)的洗脫液進入氣相色譜/質譜進行分析。(3)GC/MS分析：氣相色譜中配置有體積為200 μL的惰性石英管，由液相色譜切割過來的餾分進入到惰性石英管中，經真空蒸發排出溶劑后，再升溫氣化，由載氣輸送先后進入預柱和分析柱，經色譜分離后再進入質譜進行檢測分析。(4)固相萃取柱清洗：在氣相色譜/質譜分析過程中，前期凈化系統可同步完成固相萃取柱的清洗與平衡操作(流動相B通過泵B反向洗脫固相萃取柱，切換閥A平衡固相色譜柱)，清洗時間：流動相B沖洗10 min；平衡時間：流動相A沖洗2 min以上。

1.2.2 溶液的配制標準儲備溶液的配制：準確稱取0.1 g標準品NNN，NNK，NAT，NAB(精確至0.1 mg)，用二氯甲烷溶解并定容，配制成濃度為1.0 mg/mL的混合標準儲備溶液，密封貯存于—20 ℃冰箱。內標儲備溶液的配制：準確稱取0.1 g的內標物NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4(精確至0.1 mg)于100 mL容量瓶中，加入二氯甲烷，待完全溶解后定容，得到1.0 mg/mL的混合內標儲備溶液，密封貯存于—20 ℃冰箱。后續實驗以二氯甲烷逐級稀釋混合標準儲備溶液，得到0.10～15 ng/mL的系列標準工作溶液，其中，標準工作溶液中內標物的濃度均為1.0 ng/mL。以二氯甲烷為溶劑，稀釋混合內標儲備溶液濃度至1.0 ng/mL，作為樣品萃取溶液。

1.2.3 樣品前處理及分析按照國家標準(GB/T 16447-2004)[12]規定的方法平衡卷煙樣品48 h，然后利用SM450型直線型吸煙機抽吸5支卷煙樣品，并根據國家標準(GB/T 19609-2004)[13]中規定方法捕集煙氣，將捕集了主流煙氣總粒相物的劍橋濾片轉移至50 mL的錐形瓶中，加入20 mL樣品萃取液，超聲萃取40 min后，取上清萃取液過0.22 μm有機相濾頭后進樣分析。

1.2.4 儀器分析條件參照文獻報道[6]，對色譜及質譜條件進行設置。氣相色譜系統的預柱為DB-5 MS柱(5 m×0.25 mm×0.25 mm)；分析柱為HP-5MS柱(30 m×0.25 mm×0.25 mm)；載氣為氦氣(純度≥99.999%)；流量為1.2 mL/min；進樣口溫度250 ℃；色譜柱升溫程序：初始溫度150 ℃，保持1 min，以20 ℃/min速率升至190 ℃，再以2 ℃/min速率升至250 ℃，保持20 min。

質譜條件：電離方式為EI源；電離能量30 eV；離子源溫度250 ℃；四極桿溫度120 ℃；掃描模式為選擇離子監測(SIM)模式；NNK、NNN、NAT、NAB的定量離子分別為m/z177、177、159、161；其4種同位素內標的定量離子分別為m/z181、181、163、165。

2 結果與討論

2.1 樣品萃取前處理條件的選擇

二氯甲烷常用于劍橋濾片中TSNAs的萃取[4,6]，本文不再做萃取溶液的優化選擇。利用1.2.3項下的前處理方法收集5支卷煙主流煙氣的總粒相物，利用20 mL二氯甲烷(含內標)進行超聲萃取。實驗結果表明當萃取時間達35 min后，TSNAs的萃取效果已不發生變化，考慮到不同類別卷煙樣品的萃取效果，特優選40 min作為樣品萃取時間。

2.2 固相萃取柱的選擇

將堿性氧化鋁在線固相萃取柱應用于凝膠凈化-氣相色譜聯用儀中(替代凝膠凈化柱)，相較于凝膠凈化，提取液可以大體積進樣，且待目標物富集后，還可以通過固相萃取柱的反接，集中洗脫TSNAs，避免前期前處理造成目標物峰展寬及分散，影響色譜分析；同時，實驗還對固相萃取柱的柱容量進行了考察：實驗中裝填的固相萃取柱規格為10×2.0 mm，3～5 μm，理論萃取容量為5.0 mg，遠遠高于樣品中的TSNAs含量(ng級別)，可以滿足大體積進樣的要求。

2.3 洗脫溶劑的選擇

通過文獻調研[4,6]和實際分析發現，利用二氯甲烷作為洗脫溶劑時，樣品中的TSNAs能較好的保留在堿性氧化鋁固相萃取柱上，達到一定的凈化效果，且樣品萃取液也為二氯甲烷可以保證前處理系統溶劑的一致性。清洗固相萃取柱：待樣品萃取液進樣完成富集后，利用1 mL二氯甲烷進行固相萃取柱的清洗凈化，通過實驗發現，樣品完全過完柱子需1.5 min，其中樣品200 μL，包括死體積100 μL，待過完柱后，用流動相A繼續洗滌5.0 min，部分小極性雜質被洗出；洗脫固相萃取柱：選擇二氯甲烷-甲醇(92∶8)為洗脫溶劑進行優化實驗，前0.3 min(死體積)的流出液均排入廢液，通過閥B切割隨后洗脫溶劑進入氣相色譜系統，結果發現：當洗脫溶劑的體積達80 μL時，TSNAs回收率可達96.8%，繼續增加洗脫溶劑的體積對回收率沒有明顯的影響。為了保證方法的穩定性和重復性，實驗對洗脫溶劑的體積進行了調整，選取切割120 mL的二氯甲烷-甲醇(92∶8)進入氣相色譜；在切割了富集部分后，繼續使用洗脫溶劑對固相萃取柱進行清洗(10 min)，以保證固相萃取柱的清潔和可重復性。當下一個樣品開始分析前，采用二氯甲烷平衡固相萃取柱2 min以上，即可進行進樣操作。

2.4 進樣量的選擇

考察了液相色譜進樣體積對分析結果和色譜峰寬的影響，在50～500 μL范圍內，隨著進樣體積的增加，氣相色譜的色譜峰略有擴寬，但不影響待測成分的完全分離，并且不同進樣體積下各待測成分的回收率均在95%以上，具有很高的回收率。在實際樣品分析中，進樣體積為200 μL時已完全能滿足樣品分析的靈敏度要求。因此，本方法選擇200 μL作為液相色譜進樣量。

通過對樣品萃取時間、固相萃取柱、洗脫溶劑與進樣量的選擇和優化，在選定條件下，4種TSNAs實際樣品的色譜圖見圖2。

圖2 4種煙草特有亞硝胺選擇離子色譜圖Fig.2 The SIM chromatogram of four TSNAs

2.5 工作曲線、檢測限和定量限

在優化確定的色譜條件下，分析前述系列標準溶液，使用保留時間與組分特征離子定性，內標法定量。以標準溶液中4種TSNAs定量離子(見1.2.4項下)的峰面積與內標定量離子峰面積之比y作為縱坐標，待測成分濃度與內標濃度之比x為橫坐標繪制標準曲線，結果見表1。從表1結果可知，4種待測目標物在0.15～10 ng/mL的線性濃度范圍內，線性相關系數>0.999，表明本方法的線性關系較好；采用3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)計算得到本方法的檢測限為0.03～0.04 ng/g，定量限為0.10～0.14 ng/g，方法靈敏度高。

表1 方法工作曲線、相關系數、檢測限及定量限

2.6 方法回收率和精密度

取已知目標物含量的相同樣品4份，按照10、20、40 ng 3個添加水平加標在劍橋濾片上，分別進行加標回收率實驗的考察，按照1.2.3項下前處理方法和1.2.4項下儀器條件進行分析，計算樣品加標回收率和相對標準偏差(RSD)。結果顯示：在3個不同添加水平下，4種TSNAs的回收率在92.4%～97.5%之間，回收率結果較為理想；日內RSD(n=7)在2.4%～3.0%之間，日間RSD(n=7)在2.8%～3.3%之間，方法穩定。

2.7 與現有方法的對比

分別采用本方法與CORESTA N°63方法測定了8個烤煙型卷煙樣品主流煙氣中TSNAs的含量，并通過配對t檢驗法對上述兩種檢測方法的測定結果進行了分析，結果表明，兩種方法的測定結果沒有顯著性差異(p>0.05)。

3 結論

針對復雜煙氣中TSNAs含量較低的檢測難題，本研究建立了測定煙氣中4種TSNAs的在線固相萃取-氣相色譜/質譜檢測方法。方法選用新型球形氧化鋁裝填的固相萃取柱進行雜質凈化，結合在線固相萃取模式，前處理操作簡單、凈化效率高且可在線完成。4種TSNAs的加標回收率在92.4%～97.5%之間，日內與日間精密度均低于3.5%，檢測限在0.03～0.04 ng/g之間，定量限在0.10～0.14 ng/g之間。本方法的靈敏度高、重復性好，可用于卷煙主流煙氣中TSNAs的高通量檢測分析。