高熒光強(qiáng)度金銀合金簇的合成及其對(duì)Hg2+的檢測(cè)

張?jiān)婄鳎?許惠鳳， 周鑫悅， 王麗麗， 陳婷婷， 胡 筱， 余麗雙*

(1.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建福州 350122;2.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建福州 350122;3.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建福州 350122)

汞是污染最為普遍、毒性最強(qiáng)的重金屬，對(duì)人體健康造成了極大危害[1]。傳統(tǒng)的Hg2+檢測(cè)方法如電感耦合等離子體發(fā)射光譜法、原子熒光法、火焰原子吸收光譜法等[2 - 4]已在實(shí)際檢測(cè)中得到很好的應(yīng)用。此外，采用諸如熒光分析[5]、電化學(xué)傳感[6]等技術(shù)進(jìn)行Hg2+的快檢方法也得到廣泛報(bào)道，這些方法在一定程度上實(shí)現(xiàn)了對(duì)Hg2+的快速靈敏檢測(cè)。即便如此，繼續(xù)尋找高效快速的分析方法仍然是研究者在Hg2+檢測(cè)中一直努力的方向。

近年來，金屬納米簇的研究受到人們的廣泛關(guān)注。所謂納米簇，通常指由幾個(gè)到幾十個(gè)原子構(gòu)成的相對(duì)穩(wěn)定的納米結(jié)構(gòu)。這種納米簇的尺寸通常小于2 nm，接近于電子的費(fèi)米波長(zhǎng)，這賦予其非常獨(dú)特的理化特性，如離散的能級(jí)和強(qiáng)熒光活性等[7 - 9]。金屬納米簇這些特性使其能夠作為理想化的納米材料用于生物醫(yī)藥及環(huán)境科學(xué)等領(lǐng)域的研究[9 - 10]。其中，貴金屬簇(Au、Ag、Pd和Pt)具有高的比表面積、豐富的表面原子以及顯著的熒光響應(yīng)等特點(diǎn)，常常作為一類新型的熒光探針[8 - 9,11]。相比單一金屬簇，雙金屬合金簇能夠通過控制原子在金屬簇中的分布以獲得額外的自由度。同時(shí)，合成的合金簇具有更優(yōu)異的光電活性，Zhang等[11]發(fā)現(xiàn)在Pb簇表面引入Au原子能顯著提高其葡萄糖氧化的活性。另有報(bào)道表明，在Au納米簇(AuNCs)中引入Ag能更有效地增強(qiáng)其熒光[12]，并且這些具有強(qiáng)熒光響應(yīng)的合金簇也能夠用于金屬離子的檢測(cè)。Jin課題組合成了硫醇類包覆的AuNCs，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ag+能明顯引起該金簇?zé)晒鈴?qiáng)度的增強(qiáng)，從而可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Ag+檢測(cè)[13]。而采用不同模板合成的Au/AgNCs也能夠?qū)r3+、Cr6+、As3+等重金屬離子進(jìn)行定量檢測(cè)[14 - 15]。

截止目前，已有多種生物分子比如蛋白質(zhì)、多肽和寡核苷酸[16 - 19]等被用作合成金屬納米簇的模板，以增強(qiáng)其光穩(wěn)定性并減小納米簇的聚沉。本研究以牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)為模板合成了具有強(qiáng)熒光響應(yīng)的金銀納米簇(BSA-Au/AgNCs)，并以此為熒光探針來構(gòu)建檢測(cè)Hg2+的方法。該方法對(duì)Hg2+的響應(yīng)范圍為2～30 nmol/L，檢測(cè)限達(dá)到0.6 nmol/L。同時(shí)，該方法對(duì)Hg2+有良好的特異性，可以對(duì)實(shí)際水樣中汞的含量進(jìn)行測(cè)定。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

FS5型熒光光譜儀(英國(guó)，Edinburgh公司)；AVATAR360型傅立葉變換紅外光譜儀(美國(guó)，Nicolet公司)；TECNAI G2F20型高分辨率透射電子顯微鏡(美國(guó)，F(xiàn)EI公司)；QL-866型振蕩器(江蘇海門其林貝爾儀器制造有限公司)；KQ520DB型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

牛血清白蛋白(BSA)、HAuCl4·3H2O購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司；NaOH、Na2HPO4·12H2O，NaH2PO4·12H2O、AgNO3、Hg(NO3)2等購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；其余試劑均為分析純。水為去離子水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BSA-Au/AgNCs的合成所有用于合成BSA-Au/AgNCs的玻璃器皿事先都先用王水浸泡4 h，然后用乙醇漂洗，最后用水沖洗干凈。合成方法參考文獻(xiàn)方法[18]。將5.0 mL 50 mg/mL BSA溶液和4.0 mL 1.0×10-2mol/L HAuCl4溶液混合，接著加入1.0 mL不同濃度的AgNO3溶液，室溫振蕩10 min，立即加入1.0 mL 1.0×10-3mol/L NaOH溶液，在37 ℃下反應(yīng)12 h。將反應(yīng)液先使用30 000 MW的濾膜處理，4 ℃下3 000 r/min離心15 min，去除未反應(yīng)的BSA。再使用水對(duì)其透析48 h(每6 h換一次水)，以除去未反應(yīng)的HAuCl4和NaOH。最后將得到的BSA-Au/AgNCs溶液4 ℃放置以備用。取1 mL溶液凍干后稱重，計(jì)算得到最終BSA-Au/AgNCs母液的濃度為3.4 mg/mL。

1.2.2 Hg2+的熒光檢測(cè)取100 μL上述BSA-Au/AgNCs溶液，加900 μL濃度為2.0×10-2mol/L磷酸鹽緩沖液(PBS,pH=7.0)，得到濃度為0.34 mg/mL的BSA-Au/AgNCs溶液。分別移取1 μL不同濃度的Hg2+溶液加入到1 mL上述BSA-Au/AgNCs溶液中，進(jìn)行熒光測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 BSA-Au/AgNCs的合成及表征

圖1A為BSA-Au/AgNCs在激發(fā)波長(zhǎng)280 nm處的熒光光譜圖，由圖可見最大發(fā)射波長(zhǎng)為625 nm。這些熒光特征與文獻(xiàn)報(bào)道的基本一致[19]，表明實(shí)驗(yàn)已經(jīng)成功合成了BSA-Au/AgNCs。日光下制備的BSA-Au/AgNCs呈棕黃色(如圖1A插圖a)，而在365 nm的紫外燈下顯示出很強(qiáng)的橘紅色熒光，如圖1插圖b所示。

圖1 BSA-Au/AgNCs的熒光光譜(A)和紅外光譜(B)圖Fig.1 Fluorescence spectra(A) and IR spectra(B) of BSA-Au/AgNCsInset a in Fig.A:Image of BSA-Au/AgNCs under the daylight lamp; Inset b:Image of BSA-Au/AgNCs under 365 nm UV light;Inset c:HRTEM image of BSA-Au/AgNCs.

利用高分辨透射電鏡(HRTEM)研究了合成的BSA-Au/AgNCs的尺寸。如圖1插圖c所示，可以觀察到合成的BSA-Au/AgNCs尺寸約4 nm，表明BSA-Au/AgNCs具有高度結(jié)晶的結(jié)構(gòu)。利用紅外光譜表征了BSA-Au/AgNCs的結(jié)構(gòu)信息，結(jié)果如圖1B所示。其中曲線a為BSA-Au/AgNCs的紅外譜，曲線b為BSA的紅外光譜。與BSA的紅外光譜相比，BSA-Au/AgNCs的紅外光譜在1 654 cm-1的特征吸收峰有較為明顯的減弱，這表明反應(yīng)后蛋白質(zhì)的α螺旋結(jié)構(gòu)減少了，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，同時(shí)在蛋白質(zhì)中巰基與Au、Ag形成共價(jià)鍵。

2.2 BSA-Au/AgNCs對(duì)Hg2+的熒光響應(yīng)

考察了Hg2+存在時(shí)BSA-Au/AgNCs為熒光探針熒光信號(hào)變化情況，結(jié)果如圖2所示。從圖中可以看出，本實(shí)驗(yàn)合成的BSA-Au/AgNCs在625 nm處顯示出很強(qiáng)的熒光(曲線a)，而隨著Hg2+的加入，BSA-Au/AgNCs的熒光信號(hào)強(qiáng)度顯著降低(曲線b)。圖2的插圖是在365 nm紫外燈下，在不同條件下的BSA-Au/AgNCs的熒光圖。在紫外燈下，單純的BSA-Au/AgNCs呈現(xiàn)出明亮的橙紅色(插圖a)，而加入Hg2+后，明亮的橙紅色幾乎完全褪去，而顯示出微弱的藍(lán)光(插圖b)。這一結(jié)果表明，Hg2+可有效地猝滅BSA-Au/AgNCs的熒光。其原因可能是Hg2+與BSA-Au/AgNCs表面的Au+之間存在著高特異性的Hg2+-Au+噬金屬效應(yīng)(Metallophilic Interactions)，導(dǎo)致BSA-Au/AgNCs的熒光猝滅。所謂的噬金屬效應(yīng)[19]是指一些閉殼層金屬(Closed-shell Metal)原子或離子間存在著的高親和性作用力，如Cu+(3d10)與Ag+(4d10)或Hg2+(5d10)與Au+(5d10)。這些閉殼層金屬間強(qiáng)的相互作用力能夠?qū)崿F(xiàn)某些金屬離子的特異性檢測(cè)。

2.3 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.3.1 Au和Ag配比的選擇固定BSA的用量，調(diào)整HAuCl4和AgNO3的比例，分別合成不同Au、Ag比例的合金簇，并考察不同比例的Au、Ag合金簇的熒光光譜。如圖3所示，當(dāng)Au∶Ag=3∶1時(shí)，得到的合金簇的熒光強(qiáng)度最強(qiáng)(曲線b)。因此，實(shí)驗(yàn)選擇Au、Ag比例為3∶1合成BSA-Au/AgNCs。

圖2 加入Hg2+前(a)、后(b)BSA-Au/AgNCs的熒光光譜和紫外燈下圖片F(xiàn)ig.2 Fluorescence spectra and image under UV light of BSA-Au/AgNCs without (a) and with (b) Hg2+a.in the absence of Hg2+;b.in the presence of 3.0×10-8 mol/L Hg2+.

圖3 不同Au、Ag比例BSA-Au/AgNCs的熒光光譜Fig.3 Fluorescence spectra of BSA-Au/AgNCs with different molar ratiosa.Au∶Ag=4∶1;b.Au∶Ag=3∶1;c.Au∶Ag=2∶1;d.Au∶Ag=1∶1;e.Au∶Ag=0.5∶1.

圖4 Hg2+和BSA-Au/AgNCs(Au∶Ag=3∶1)反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 The dynamics curve between BSA-Au/AgNCs(Au∶Ag=3∶1) and Hg2+The final concentration of Hg2+ and BSA-Au/AgNCs are 2.0×10-8 mol/L and 0.34 mg/mL in 0.02 mmol/L PBS buffer(pH=7.0),respectively.

2.3.2 反應(yīng)時(shí)間的選擇反應(yīng)時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果有很大影響。實(shí)驗(yàn)考察了Hg2+對(duì)BSA-Au/AgNCs熒光響應(yīng)的情況。從圖4中可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，熒光強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)反應(yīng)10 min后，熒光降低趨于緩慢，因此在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，所有反應(yīng)時(shí)間均設(shè)為10 min.

2.4 線性方程及檢測(cè)限

按照上述優(yōu)化條件，實(shí)驗(yàn)研究了不同濃度Hg2+對(duì)BSA-Au/AgNCs熒光強(qiáng)度的影響。從圖5A中可以看出，隨著Hg2+濃度的增加，熒光強(qiáng)度逐漸降低。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Hg2+的濃度在一定范圍內(nèi)時(shí)(2～30 nmol/L)，熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度有著良好的線性關(guān)系，如圖5B所示，回歸方程為：y=-1224.2x(nmol/L)+47319.6，相關(guān)系數(shù)R2為0.9928，方法的檢測(cè)限(S/N=3)為0.6 nmol/L。3次平行實(shí)驗(yàn)得到結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.6%，方法具有穩(wěn)定性。

圖5 (A)不同濃度Hg2+條件下BSA-Au/AgNCs的熒光光譜；(B)熒光強(qiáng)度與Hg2+濃度的線性關(guān)系曲線Fig.5 (A) Fluorescence spectra of BSA-Au/AgNCs in the presence of different concentrations of Hg2+;(B) The relationship curve of the fluorescence intensity with Hg2+ concentrationscHg2+ (a-f):0,2,5,12,20,30 nmol/L.

圖6 不同金屬離子的響應(yīng)信號(hào)變化圖Fig.6 Signal changes responding to different metal ionsNote:The concentration of Hg2+ was 1.2×10-8 mol/L and those of other ions were 1.2×10-7 mol/L.

2.5 干擾實(shí)驗(yàn)

選用一些常見的無機(jī)離子Cu2+、Mn2+、Pb2+、Mg2+、Zn2+、Ba2+和Cd2+等作為干擾離子。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用熒光的改變量ΔF來表示，定義ΔF=F0-F,其中F0為初始熒光值，F(xiàn)為加入相應(yīng)離子后的熒光值。從圖6中可以看出，同樣條件下，Hg2+對(duì)BSA-Au/AgNCs的熒光具有顯著猝滅作用，而其他金屬對(duì)其則沒有明顯作用。由此可見，基于BSA-Au/AgNCs的熒光檢測(cè)方法對(duì)Hg2+具有良好的選擇性識(shí)別能力。

2.6 實(shí)際水樣中Hg2+的檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)中所用的水樣均采自閩江，在檢測(cè)前靜置過夜，并通過濾膜(0.22 mm)過濾掉不溶物。利用所建立方法在此水樣中進(jìn)行Hg2+的檢測(cè)，結(jié)果并沒有檢測(cè)到信號(hào)變化，其原因可能是河水中Hg2+的含量低于該方法的檢測(cè)限。在水樣中加入已知濃度的Hg2+標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如表1所示，其回收率在90.1%～107.2%范圍內(nèi)。

表1 河水樣品中Hg2+的檢測(cè)

3 結(jié)論

本文以BSA為模板，以HAuCl4和AgNO3為原料，合成了一種高熒光強(qiáng)度的Au、Ag合金簇BSA-Au/AgNCs。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由于Hg2+與BSA-Au/AgNCs表面的Au+存在的高特異性的噬金屬效應(yīng)，因而能顯著猝滅合金簇的熒光信號(hào)。本研究進(jìn)一步以該BSA-Au/AgNCs為熒光探針，開發(fā)了一種快速檢測(cè)Hg2+的方法。該檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)單，快速，靈敏度較高，不需復(fù)雜儀器；同時(shí)，合成的合金簇綠色環(huán)保。