酸性微環境對大腸癌細胞自噬及侵襲能力的影響

占義軍 許東強 李 明 譚詩云

大腸癌(colorectal cancer，CRC)是常見消化道惡性腫瘤，其發病率高居全球惡性腫瘤的第3位。盡管近年來大腸癌診療水平顯著提高，但其病死率仍高居腫瘤相關死亡的第2位[1, 2]。侵襲轉移是導致大腸癌患者臨床治療失敗和死亡的主因。研究發現，腫瘤的侵襲轉移與腫瘤細胞所處的腫瘤微環境有著密切關系[3～5]。酸性微環境(acidic microenvironment)是腫瘤的普遍特征，其與腫瘤低糖條件下的生存、侵襲轉移等均有關系，在腫瘤的發生和發展過程中均扮演重要角色[6, 7]。自噬可使細胞能夠適應缺氧、饑餓等惡劣環境并應對其他各種包括化療或放療造成的損傷刺激等，有助于細胞的存活。本研究擬在細胞培養基中加入乳酸，調節pH值為6.8，模擬酸性環境，來探討酸性環境下對大腸癌LoVo細胞侵襲能力及自噬水平的影響。

材料與方法

1.材料：大腸癌細胞系LoVo細胞購自中科院上海細胞庫。胎牛血清購自美國Gibco公司；DMEM/F-12培養基購自美國Invitrogen公司；Transwell小室、細胞培養瓶、細胞培養皿及6孔培養板均購自美國Corning公司；Matrigel膠購自美國BD公司；EMT標志物抗體(E-cadherin、Vimentin、Fibronectin)、自噬相關基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白、MMP-9及內參β-actin抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司。蛋白濃度測定試劑盒、HRP-羊抗兔、HRP-羊抗鼠及FITC-山羊抗兔熒光二抗均購自中國杭州碧云天生物技術研究所。

2.方法：(1)細胞培養：大腸癌LoVo細胞用含10%胎牛血清的DMEM/F-12培養基培養，37℃、5%CO2條件下培養。實驗細胞選用處于對數生長期的細胞。(2)Transwell實驗：該實驗分為對照組(pH值7.4)和乳酸組(20mmol/L, pH值6.8)兩組。選取Transwell小室，將對數生長期的上述2組細胞用不含血清的培養基重懸計數，接種200μl于24孔板Transwell小室上室(細胞密度為2×105/ml)，每組設3個復孔；將600μl含10%血清的培養基加入24孔板Transwell小室下室，37℃、5%CO2條件下培養24h；小心取出小室，吸干小室內培養基，PBS洗滌3次，用PBS濕潤的棉簽輕拭小室內的細胞，倒置晾干，4%多聚甲醛室溫下放置固定30min，倒置晾干，0.1%結晶紫染液室溫下染色15min，顯微鏡下取5個隨機視野計數，統計結果，實驗重復3次。(3)蛋白質印跡：接種對數生長期細胞(細胞濃度為2×105/ml)至6孔板內，每孔2ml，放置培養箱中孵育至細胞貼壁后，加入含乳酸的完全培養基分別處理細胞0、12、24h后，從培養箱中取出培養板，消化收集細胞，并用預冷的PBS洗滌后加入蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)冰上裂解反應30min，用細胞刮刮下細胞，置于EP管中，冰上靜置5min，離心(離心機預冷4℃)12000r/min離心 10min(r=8cm)，取上清，采用BCA法測定蛋白濃度，每個樣品以相同的蛋白量(40μg)加入10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉法將10%聚丙烯酰胺凝膠上的蛋白轉移至PVDF膜，經5%脫脂奶粉室溫條件下封閉1h，4℃條件下過夜孵育一抗，次日TBST洗膜后，室溫調價小孵育二抗2h， TBST洗滌后ECL化學發光試劑顯影，定影，對膠片進行拍照分析，實驗重復3次。

結 果

1.酸性環境對大腸癌LoVo細胞侵襲能力的影響：如圖1所示，Tanswell實驗結果顯示，酸性條件(pH值6.8)下處理24h后，穿過Transwell小室基膜的大腸癌細胞系LoVo細胞數為491.4±19.5個，顯著多于中性條件(pH值7.4)的353.8±24.6個，差異有統計學意義(t=7.59,P=0.002)。

圖1 酸性環境對大腸癌LoVo細胞侵襲能力的影響(#P<0.05)A.Tanswell小室檢測中性環境(pH值7.4)和酸性環境(pH值6.8)對LoVo細胞侵襲能力的影響(結晶紫，×100)；B.與中性環境(pH值7.4)穿過Transwell小室細胞數(353.8±24.6)比較，酸性環境(pH值6.8)下穿過Transwell小室人工基膜的LoVo細胞數(491.4±19.5)增加(t=7.59, P=0.002)

2.酸性環境對大腸癌LoVo細胞MMP-9表達的影響：如圖2所示，酸性條件分別處理LoVo細胞0、12、24h后，蛋白質印跡檢測結果顯示隨著作用時間的延長，MMP-9表達逐漸增加。

圖2 酸性環境對大腸癌LoVo細胞MMP-9蛋白表達的影響A.免疫印跡圖；B.MMP-9灰度值分析;與0h比較，*P <0.05

3.酸性環境對大腸癌LoVo細胞EMT標志物蛋白表達的影響：本實驗進一步探討了酸性條件下對大腸癌LoVo細胞EMT標志物表達的影響，如圖3所示，隨著作用時間的延長，上皮標志物E-鈣黏素(E-cadherin)表達逐漸下調，且間葉標志物波形蛋白(Vimentin)和纖維連接蛋白(Fibronectin)表達逐漸上調。

圖3 酸性環境對EMT標志物表達的影響A.免疫印跡圖；B.EMT標志物灰度值分析;與對應蛋白0h比較，*P<0.05

4.酸性環境對大腸癌LoVo細胞自噬相關基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達的影響：如圖4所示，酸性條件分別處理LoVo細胞0、12、24h后，蛋白質印跡檢測結果顯示隨著作用時間的延長，自噬相關基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達逐漸上調。

圖4 酸性環境對LoVo細胞自噬相關基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達的影響A.免疫印跡圖；B.自噬相關基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1標志物灰度值分析;與對應蛋白0h比較，*P<0.05

討 論

普遍認為腫瘤酸性微環境產生的機制主要包括以下因素：細胞轉化和生長失控導致的缺氧和代謝異常；腫瘤存在獨特的代謝型——瓦伯格效應，即腫瘤細胞無論在有氧還是低氧環境下均進行糖酵解，產生乳酸并排出細胞外，而腫瘤中紊亂的血管不能有效清除組織環境中的乳酸；特別地，在提高腫瘤組織的氧分壓和血流量情況下，腫瘤依然產生并維持著酸性微環境[8]。這種酸性環境可促進腫瘤細胞侵襲、化療耐藥、細胞免疫逃逸等[8,9]。本研究結果顯示，與中性條件下比較，酸性條件下，大腸癌LoVo細胞侵襲能力更強，且基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)表達上調，后者可降解細胞外基質并破壞基膜，促進腫瘤細胞從原發灶向周圍組織及遠處轉移。

上皮細胞間葉樣表型轉化(epithelial to mesenchymal transition,EMT), EMT是腫瘤原發性浸潤和繼發性轉移的重要機制，EMT是在胞外因素刺激下由上皮細胞表型轉化為具有間質細胞表型的過程[10～12]。在EMT過程中，細胞極性、細胞間緊密連接和黏附連接逐漸喪失，肌動蛋白細胞骨架發生重組，細胞-細胞間連接蛋白如E-cadherin、γ-catenin等表達減少，而間葉標志物如N-cadherin、Vimentin、Fibronctin等表達明顯增加。同時，基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteins,MMPs)如MMP-2、MMP-3及MMP-9等活性顯著增加。特別地，研究表明，EMT的激活能使非腫瘤干細胞具有腫瘤干細胞的特性如自我更新及腫瘤啟動能力[13,14]。因此，EMT過程被認為是絕大多數腫瘤細胞發生侵襲、轉移的前提。本研究結果顯示，酸性條件處理后可使結腸癌細胞系LoVo細胞的侵襲能力增加，且腫瘤細胞上皮標志物E-cadherin表達降低，且間葉標志物Vimentin、Fibronctin表達上調，提示酸性條件下可促進LoVo細胞EMT。

腫瘤細胞應對酸性應激的機制仍不明確。自噬是廣泛存在于真核細胞內利用溶酶體降解自身受損的細胞器和高分子物質的過程，是細胞應對惡劣環境的生存機制，其在腫瘤發生、進展中發揮著復雜的作用[15～18]。在腫瘤形成前，機體可通過自噬維持細胞內穩態阻止細胞惡變。但當腫瘤形成后，自噬可幫助腫瘤細胞度過不利的微環境，對腫瘤細胞起到一定的保護作用，并促進細胞侵襲[19]。但即使腫瘤形成后，也有研究顯示自噬對腫瘤細胞可產生抑制作用[20]。自噬的這種雙重調節作用已經在臨床研究中不斷被證實[21,22]。酸性微環境是腫瘤的普遍特征，研究發現酸性條件下，人類乳腺癌細胞內Atg5和Bnip3表達水平升高，提示細胞暴露在低pH值可能利用自噬作為一種生存機制[23,24]。本研究也發現酸性條件下，LoVo細胞自噬相關基因Atg5、LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白表達上調，提示LoVo細胞自噬水平升高。推測腫瘤細胞可能通過調節自噬來耐受酸性微環境來繼續生存。

綜上所述，酸性條件下LoVo細胞侵襲能力顯著增加，腫瘤細胞上皮標志物E-cadherin表達降低，且間葉標志物Vimentin、Fibronctin表達上調。同時，酸性條件下也可誘導LoVo細胞發生自噬。提示腫瘤酸性微環境對腫瘤細胞自噬狀態及間質化特征有著重要作用，且提示細胞自噬與細胞上皮間質轉化之間存在相互影響的關系，下一步將深入探討酸性環境誘導的自噬在大腸癌侵襲、轉移中的作用及機制，并闡明酸性微環境誘導自噬的機制，為尋找新的抑制大腸癌侵襲、轉移治療方案提供理論基礎。