TNIP1/ANXA6 基因多態性與中國維吾爾族尋常型銀屑病臨床表型及病情相關性研究

丁 媛 馮燕艷 向 芳 劉建勇 康曉靜

銀屑病是一種復雜的、炎性的、免疫學介導的、多因素的和過度增殖的皮膚病，遺傳和環境因素在其病因學中發揮著重要意義，約1%～3%的世界人口都患有銀屑病，不同種族后裔的患病率差異很大，表明銀屑病易感性存在種族間差異。國內外不同研究者應用遺傳連鎖分析原理，通過全基因組掃描研究共發現了至少12個不同的(PSORS)銀屑病易感基因位點，然而，大多數PSORS基因座的基因易感性仍不清楚[1]。近年來研究顯示許多NF-κB通路下調的基因具有銀屑病易感性，包括TNIP1和ANXA6(TNFAIP3相互作用蛋白1和膜聯蛋白A6)[2]。為研究TNIP1/ANXA6基因與新疆維吾爾族尋常型銀屑病人群相關性，筆者選擇位于TNIP1/ANXA6基因區域的rsl7728338、rs999556 2個位點單核苷酸基因多態性(single nucleotidepolymorphisms，SNP)進行分析，采用連接酶檢測反應(ligasedetection reaction，LDR)對上述基因進行基因分型，探討其與維吾爾族人群尋常型銀屑病臨床表型尤其是疾病嚴重程度的相關性。

對象與方法

1.研究對象：選取新疆自治區人民醫院皮膚性病科332例維吾爾族尋常型銀屑病患者，診斷符合尋常型銀屑病的診斷標準。 銀屑病病情輕重參照銀屑病皮損面積和嚴重程度指數(PASI)標準計分，根據不同部位的皮損面積和紅斑、鱗屑、浸潤的嚴重程度，計算綜合積分。PASI≥10分為重型，<10分為輕型。 330例年齡與性別匹配的健康人來自新疆維吾爾自治區人民醫院體檢中心的維吾爾族健康人群或者來自皮膚科門診無自身免疫性和系統性疾病的維吾爾族非銀屑病患者，同時排除其一、二、三級親屬患有銀屑病。采集外周靜脈血 5ml，乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，置于-80℃冰箱保存備用。本研究已通過新疆維吾爾自治區人民醫院倫理學委員會批準，并在實施過程中遵守赫爾辛基宣言，所有病例及對照均簽署知情同意書。

2.SNP選擇：根據既往文獻選擇2個SNP(rsl7728338和rs999556)進行分型實驗。

3.研究方法：(1)基因組 DNA 提取：利用基因組 DNA 提取試劑盒(Qiagen)DNA 抽提試劑盒(250) 提取患者及對照基因組DNA，用分光光度儀分別于260nm和280nm波長處檢測吸光度，計算DNA濃度，并用凝膠電泳檢測DNA質量，所有DNA樣本均合格。 (2)引物及探針的合成：用在線軟件Primer3input 設計特異性引物，rsl7728338上游引物:5′-AAAATGTGGTTTGTTCAGC-3′,下游引物:5′-TAGGAAGGCAGGGTGCATT-3′。rs999556上游引物:5′-TTTCGCCCCTGTCATCTGGT-3′,下游引物:5′-TGCCCAAGGTCAAAGGATGA-3′。根據Oligo軟件設計LDR探針，根據LDR探針設計原則設計LDR的上下游探針[3]。(3)多重PCR和LDR反應體系：PCR反應體系(20μl)為：1μl模板，2μl緩沖液，0.6μl Mg2+,2μl dNTP,0.2μl TaqDNA聚合酶，2μl引物混合液，PCR專用水補齊12.2μl。PCR反應條件：95℃預變性2m→94℃變性30s→56℃退火1.5min→65℃延伸30s(進行35個循環)→65℃延伸10m→產物于-20℃保存備用。LDR反應體系(10μl)為：內含4μl PCR產物，1μl×緩沖液, 1μl探針混合液，0.05μl Taq DNA連接酶，，PCR專用水補齊4μl。LDR反應循環條件：95℃變性2min→94℃15s→50℃ 25s(40個循環)→產物于-20℃保存備用。(4)測序與基因分型：擴增產物送至上海生工公司測序,測序儀器為美國 ABI3730型DNA全自動測序儀完成測序并記錄結果。 最后用Genemapper軟件進行數據分析，判讀各位點上各樣本的基因分型。

結 果

1.基線資料:病例組244例男性和88例女性銀屑病患者，對照組248例男性和82例女性健康志愿者。病例組平均年齡為40.83±23.52歲。在病例組中觀察到的活動評分(PASI)平均為9.3±8.8分。332例病例組中，早發患者≤40歲有200例，>40歲有132例。其中斑塊狀銀屑病有304例，點滴狀銀屑病28例，伴有關節損害有127例，伴有指甲的損害有161例，有銀屑病家族史57例，PASI評分≥10分有183例。病例組和對照組在年齡、性別上比較差異無統計學意義(P>0.05),詳見表1。

表1 病例組和對照組年齡及性別分布

2.病例組和對照組間TNIP1/ANXA6基因多態性rs17728338和rs999556 位點基因型和等位基因分布頻率比較：病例組與對照組間TNIP1/ANXA6基因多態性rs17728338位點的基因型、等位基因分布頻率比較，二者之間差異有統計學意義(P<0.05)，病例組和對照組間rs999556位點的基因型、等位基因分布頻率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見表2。

3.TNIP1/ANXA6 SNP基因型與等位基因在維吾爾族尋常型銀屑病中臨床表型的分布:TNIP1/ANXA6rs17728338、rs999556 的基因型、等位基因在維吾爾族尋常型銀屑病患者臨床表型(性別、患病年齡、分型、累及指甲、累及關節、家族史、病情輕重)進行分層比較所得χ2值、P值、OR(95% CI) 分布,見表3、表4。 TNIP1/ANXA6rs17728338位點分層分析中的基因型、等位基因在有家族史組與無家族史組之間比較差異有統計學意義(P<0.05)，TNIP1/ANXA6rs17728338位點的基因型、等位基因在PASI評分≥10分和PASI評分<10分之間比較，差異有統計學意義(P<0.05)，在其他臨床分層分析中比較，差異無統計學意義(P>0.05)。TNIP1/ANXA6rs999556的基因型、等位基因在年齡、分型、是否累及指甲、是否累及關節、家族史、病情輕重分層分析后發現差異無統計學意義(P>0.05)。

表2 病例組及對照組TNIP1/ANXA6rs17728338、rs999556等位基因與基因頻率分布

表3 TNIP1/ANXA6 rs17728338、rs999556基因型在維吾爾族尋常型銀屑病中臨床表型的分布

討 論

研究認為銀屑病是具有遺傳背景的人群在環境的作用下，通過天然免疫系統過度活化引起的，銀屑病表皮的過度增生就是皮膚天然免疫系統被過度激活的結果[4,5]。TNIP1基因通過TNF-α受體、表皮生長因子(EGF)受體和Toll樣受體抑制核因子κB(NF-κB)信號轉導。NF-κB是一種天然免疫應答中的關鍵轉錄因子，同時在銀屑病患者體內TNIP1有一個被改變的甲基化模式導致TNIP1在銀屑病皮膚上調[6]。TNIP1不僅僅是銀屑病的易感基因位點，也是系統性紅斑狼瘡、干燥綜合征和類風濕性關節炎的易感基因位點[7,8]。 ANXA6基因通過調節EGF受體相關的細胞轉導信號通路，在細胞表面，EGF受體被激活后可以觸發了復雜的網絡，發出各種信號調節來調節角質形成細胞的分化，從而參與銀屑病的發病過程[9，10]。Zhang等[11]通過GWAS證實TNIP1/ANXA6基因為漢族人尋常型銀屑病的易感基因，這兩個基因共同的易感位點rs3762999和rs999556和高加索人報道的rsl7728338均在同一區域。

表4 TNIP1/ANXA6rs17728338、rs999556等位基因在維吾爾族尋常型銀屑病中臨床表型的分布

*P<0.05

張麗君等[12]研究發現，ANXA6基因多態性rs999556和rs3762999與漢族人尋常型銀屑病發病的易感性相關，rs999556與該病的臨床類型相關，與發病年齡和家族史不相關；rs3762999與該病的發病年齡、家族史及臨床類型均不相關 。本研究發現在維吾爾族銀屑病患者TNIP1/ANXA6基因多態性rs999556位點與對照組等位基因及基因型頻率差異均無統計學意義，且rs999556位點的基因型、等位基因與該病的臨床類型、發病年齡、家族史、伴隨的臨床癥狀、疾病嚴重程度比較差異均無統計學意義，rs999556可能為漢族群體所獨立具有的銀屑病易感位點。而在病例組和對照組中rs17728338位點基因型、等位基因比較差異有統計學意義，提示TNIP1/ANXA6基因rs17728338位點是維吾爾族人群的易感位點，維吾爾族可能和漢族人群、高加索人群有著共同的致病位點，提示在這些不同種族人群中銀屑病發病可能存在的共同機制。

韓建文等[3]研究發現，TNIP1基因區域的3個單核苷酸多態性(SNP)，即rs17728338、rs3762999和rs999556在465例漢族尋常性銀屑病患者和476例健康對照組中比較差異有統計學意義，分層分析發現，rs17728338的基因型頻率在早發型、晚發型、有家族史、無家族史尋常性銀屑病組間比較差異均有統計學意義，而且均顯示為顯性遺傳模式，提示TNIP1基因在銀屑病發病機制中發揮著重要的作用，緊接著該項研究還證明了TNIP1基因的5個單核苷酸片段rs3805435、rs3792798、rs3792797、rs869976、rs17728338和rs999011在泛發性膿皰型銀屑病病例組和對照組中差異有統計學意義，尤其是在沒有尋常型銀屑病皮損的患者中，但在掌跖膿皰病中沒有差異性，從而證明TNIP1基因是泛發性膿皰型銀屑病的易感基因[13]。本研究也證實了TNIP1/ANXA6基因rs17728338位點的基因型頻率在有家族史及無家族史的維吾爾族尋常型銀屑病患者中比較差異有統計學意義。證明了TNIP1/ANXA6基因多態性rs17728338對于家族史陽性的漢族、維吾爾族發病風險相對較大，與既往在漢族銀屑病人群中研究結果相一致。

Zhang等[14]研究發現TNFAIP3基因rs610604基因多態性和尋常型銀屑病的發生相關，患者病情分層分析(PASI≥6分和PASI<6分之間)發現上述兩項差異仍有統計學意義。Indhumathi等[15]研究發現，在南印度泰米爾人群中360例尋常型銀屑病患者和360例對照組中TNFAIP3(rs610604)、TNIP1 (rs17728338) 的基因多態性比較差異有統計學意義，其前者和家族史相關，后者和疾病的PASI評分可能相關，雖然顯性模式下比較差異無統計學意義，但在基因型AA的頻率上比較差異有統計學意義。本研究發現，TNIP1/ANXA6基因rs17728338的基因型、等位基因在病情分層分析(PASI≥10分和PASI<10分之間)比較差異有統計學意義，提示TNIP1/ANXA6基因多態性rs17728338和維吾爾族尋常型銀屑病病情相關。而在性別、早發晚發、斑塊狀銀屑病和點滴狀銀屑病、有無關節損害、有無指甲損害均未發現TNIP1/ANXA6基因多態性rs17728338的基因型、等位基因分布存在差異。

Yin等[16]研究發現,TNIP1/ANXA6基因多態性rs3762999(P=0.0257) 和 rs999556(P=0.0071)在飲酒和不飲酒漢族銀屑病人群中比較，差異有統計學意義，在吸煙和不吸煙的漢族銀屑病人群中 CSMD1基因多態性rs7007032 (P=0.0023)和rs10088247(P=0.0023) 比較，差異有統計學意義，此項研究進行了基因和環境交互作用的相關分析。本研究沒有針對TNIP1/ANXA6基因多態性和維吾爾族銀屑病人群的生活習慣相關性進行分析，可以在今后的研究中進一步證實。

綜上所述，TNIP1/ANXA6基因rs17728338與維吾爾族尋常型銀屑病發病的易感性相關，rs17728338對于家族史陽性的維吾爾族發病風險相對較大，且和維吾爾族尋常型銀屑病病情相關。TNIP1/ANXA6基因多態性rs999556和維吾爾族尋常型銀屑病發病的易感性不相關，與漢族人群研究結果不同，進一步證明了不同種族人群的遺傳異質性。