健脾益氣攝血顆粒影響免疫性血小板減少癥患者出血與免疫功能研究

郎海燕 張 玲 王 佳 張雅月 王 沖 范秋月 張佳諾 陳信義

原發免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一類由細胞和體液免疫異常導致血小板破壞增多的自身免疫病[1]。ITP臨床表現以廣泛的皮膚、黏膜出血為主，急性發病者可出現危及生命的內臟出血或腦出血，且出血風險隨年齡的增加而增加，但與患者外周血小板數量減少程度并不一致，尤其慢性患者甚至血小板計數不在安全水平，也不會發生廣泛或嚴重出血。因此，對于ITP的治療除有效地防治出血癥狀，穩定外周血小板數值在安全水平外，控制或改善患者臨床癥狀，特別是乏力癥狀至關重要。通過臨床實踐證明，以中醫藥為主或輔助治療在防治ITP患者出血、穩定外周血小板數值以及改善臨床癥狀等方面具有明顯優勢。因此，筆者在協作進行國家重點基礎研究發展計劃(“973”計劃)項目臨床試驗過程中，分別檢測了患者經健脾益氣攝血顆粒治療前后血小板相關抗體、T淋巴細胞及其亞群變化，以期證實健脾益氣攝血顆粒具有免疫調控效果。

對象與方法

1.病例標準:(1)免疫性血小板減少癥診斷標準:參照《血液病診斷及療效標準》制定的ITP診斷標準[2]：①多次實驗室檢查血小板計數減少；②脾臟不增大或僅輕度增大；③骨髓檢查巨核細胞增多或正常，有成熟障礙；④以下5點中應具備任何1點：A.潑尼松治療有效；B.切脾治療有效；C.PAIgG(血小板抗體IgG)增多；D.PAC3(血小板抗體補體C3)增多；E.血小板壽命縮短；⑤并可排除繼發性血小板減少癥。(2)脾不統血證診斷標準:參照《中藥新藥臨床研究指導原則》中“中藥新藥治療脾虛證臨床研究指導原則”與“中藥新藥治療氣虛證臨床研究指導原則”[3]，結合疾病臨床特征擬定“脾不統血證”標準[4]：①主癥：慢性出血(反復皮下瘀點或瘀斑，色澤淡；月經過多或經期延長等)，伴隨體倦乏力、神疲懶言；②次癥：食欲不振、食后腹脹；③舌脈：舌體胖大，邊有齒印，舌淡；脈象細弱。具備主癥2項(第1項必備)，次癥1項，結合舌脈可診斷。(3)出血程度與血小板減少分級標準:參照2010年衛生部醫政司發布的《免疫性血小板減少性紫癜臨床路徑》，將出血程度與血小板計數減少分4級并記分，見表1[5]。(4)納入病例標準:同時具備下列3項：①符合免疫性血小板減少癥疾病診斷標準；②符合中醫“脾不統血”中醫證候辨證標準；③自愿受試，并簽署知情同意書。(5)排除病例標準:具備下列任意1項：①合并嚴重心臟、腦、肝臟、腎臟疾病；②精神病患者；③妊娠、哺乳期婦女；④有嚴重糖尿病、高血壓并發癥患者；⑤已知對受試藥物或處方中某個單味中藥過敏者。(6)中止和剔除病例標準：符合下列任意1項：①不能堅持治療；②臨床試驗中出現嚴重不良反應或嚴重并發癥；③病情加重，需另行治療。

表1 血小板計數減少與出血程度分級記分標準

2.研究方法：(1)臨床分組與治療方法:用中國中醫科學院臨床評價中心設計的中央隨機系統，按隨機抽取的藥物編號將受試者分配到健脾益氣攝血顆粒組(試驗組)、健脾益氣攝血顆粒聯合潑尼松組(聯合組)、潑尼松組(西藥組)。健脾益氣攝血配方顆粒(黃芪20g、黨參15g、茯苓15g、白術10g、阿膠15g、茜草10g、炙甘草6g；北京康仁堂藥業有限公司)，每次1袋，每日2次；潑尼松首次劑量按1.0～1.5mg/(kg·d)，早8：00時頓服，治療期間有效減量。健脾益氣攝血聯合強的松組聯合使用健脾益氣攝血配方顆粒和潑尼松(用量用法同上)。21天為1個療程。(2) 觀察指標檢測方法：于第1、7、14、21天進行訪視，觀察患者出血程度變化，并采集患者外周血，應用全自動血細胞分析儀器檢測外周血象中血小板計數，進行血小板減少程度評分值；于第1、4次訪視點，采集患者外周血，送北京海思特臨床檢驗所，按T淋巴細胞亞群檢測試劑盒說明，流式細胞儀法檢測淋巴細胞及其相關亞群；以酶聯免疫競爭抑制法(ELISA)檢測血小板相關抗體(PAIgG、PAIgA、PAIgM)。

3.統計學方法：同一組治療前后比較若差值符合正態分布，采用配對t檢驗；若前后差值非正態分布，采用符號Wilcoxon秩和檢驗。組間比較時，若同時符合正態分布且方差齊，則采用ANOVA單因素方差分析；若各組均正態分布但方差不齊，采用Welch檢驗；若非正態分布，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗。頻數及構成比的檢驗采用χ2檢驗/Fisher確切概率法(當理論頻數<5的單元數超過20%時)，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.一般資料:采用中國中醫科學院臨床所設計的中央隨機系統，按照臨床試驗方案規定入選病例標準，自2012年8月～2016年8月，由北京中醫藥大學東直門醫院等18家三級甲等中醫醫療單位競爭入組ITP患者273例，經反復核對臨床試驗資料，有1例因不符合入選標準而剔除，進入全分析集受試者共272例(試驗組104例，聯合組103例，西藥組65例)。入組時人口學資料見表2。

表2 3組病例入組時人口學資料

2.出血程度與血小板計數減少評分值變化：3組病例出血與血小板計數減少評分值觀察結果見表3。

表3 3組病例出血程及血小板計數減少評分值比較分)

與治療前比較，*P<0.05；與試驗組相同時間點比較，#P<0.05；與西藥組相同時間點比較，△P<0.05

從治療第7天開始，試驗組、聯合組的出血程度評分值較入組時明顯下降，與治療前比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而西藥組從14天開始積分下降。說明西藥組止血效果晚于試驗組、聯合組。3組病例治療后各訪視點血小板計數減少程度評分值較治療前有所下降，差異有統計學意義(P<0.05)。末次訪視點，聯合組血小板評分值下降幅度最優，與試驗組相同時間點比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

3.T淋巴細胞亞群測定值變化:3組病例T淋巴細胞亞群檢入結果見表4。試驗組CD4+CD25+治療后測定值與治療前比較，差異有統計學意義(P<0.05)，其余各組比較差異無統計學意義(P>0.05)。

4.T淋巴細胞亞群正常和異常比例:3組病例T淋巴細胞亞群正常和異常百分比統計結果見表5。

表4 3組病例T淋巴細胞亞群測定值比較

與治療前比較，*P<0.05；與試驗組治療后比較，△P<0.05

第4次訪視點聯合組檢測的CD3+CD4+細胞、CD19+細胞正常和異常例數，與試驗組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

5.血小板相關抗體變化：3組病例血小板相關抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM檢測結果見表6。各組治療前后血小板抗體測定值組內或組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

討 論

ITP的確切發病機制目前尚不清晰，目前普遍認為該病為異質性免疫性疾病，體液與細胞免疫功能失調承擔著始動角色。在體液免疫方面，抗體介導的血小板破壞被認為是ITP的經典發病機制，現已證實50%～60%的ITP患者血小板表面可檢測到抗血小板糖蛋白的血小板自身抗體，包括血小板相關抗體(PAIg)和血小板特異性抗體(PSIg)。這些抗體主要是IgG型，也有IgM、IgA等。抗體與血小板膜抗原結合后形成抗原抗體復合物，由單核-吞噬細胞攝取后在脾臟中被破壞。吳意紅等[6]研究發現，歸脾丸不僅能夠提高患者外周血小板計數，亦能降低血小板相關抗體PAIgG、PAIgA、PAIgM，總體療效與激素相當。B細胞通常作為抗原遞呈細胞產生抗體，促進CD4+T細胞分化，在免疫應答中發揮重要調節作用，也可以通過分泌調節細胞因子或通過細胞與細胞接觸，直接與病原的T細胞相互作用，從而在免疫應答中發揮負性調節作用。這類B細胞被稱作調節性B細胞[7，8]。細胞免疫異常在ITP發生、發展過程中也有重要作用，調節性T細胞(Treg)是一類具有免疫調節功能的特殊T細胞亞群。有研究表明，ITP患者存在Treg細胞數量及功能的異常[9,10]，與正常對照比較，ITP 患者尤其是活動性和(或)血小板計數特別低的患者，外周Treg數量明顯減少。目前研究較多的是檢測CD4+CD25+Treg細胞，其是近幾年發現的一種特殊的專職免疫調節細胞，主要通過抑制免疫效應細胞增殖、分化及其免疫功能和抑制自然殺傷細胞、細胞毒T細胞等細胞的功能來維持自身免疫平衡。有研究者通過不同實驗方法均得出一致結論，初診和復發的ITP患者體內CD4+和CD25+Treg細胞明顯低于正常對照組和緩解期ITP患者，表明ITP患者體內可能由于缺乏Treg細胞，從而使自身免疫反應不能被有效抑制，導致自身免疫平衡失調[11]。Arandi等[12]報道，ITP患者CD4+CD25+FoxP3+Treg細胞數量明顯減少，功能降低。吳曉勇等[13]建立ITP小鼠動物模型，檢測脾Treg細胞，發現Treg細胞比例減少、TGF-β1水平降低與ITP的細胞免疫失調相關。上述研究充分證明，T、B細胞免疫功能紊亂在ITP發病機制中占有重要位置。

表5 3組病例T淋巴細胞亞群正常與異常病例數比較 [n(%)]

與試驗組比較，*P<0.01；治療前后正常/異常應等于本組入組病例數，本表治療前后病例數少于入組病例數均為該項目檢測的缺失病例數

表6 3組病例治療前后血小板抗體測定值比較(ng/ml)

本研究從治療第7天開始，試驗組、聯合組的出血程度評分值較入組時明顯下降，與治療前比較，差異有統計學意義(P<0.05)，而西藥組從14天開始。說明西藥組止血效果晚于試驗組、聯合組；3組病例治療后各訪視點血小板計數減少程度評分值較治療前有所下降，差異有統計學意義(P<0.05)。末次訪視點，聯合組血小板評分值下降幅度最優，與試驗組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。該項研究從臨床角度證明，益氣健脾攝血顆粒對ITP有明確的治療效果。試驗組CD4+CD25+細胞療后測定值與療前比較，差異有統計學意義(P<0.05)，其余各組差異無統計學意義(P>0.05)。表明健脾益氣攝血顆粒能夠升高CD4+CD25+細胞，調節ITP患者紊亂的免疫機制，維系自身免疫穩態。與試驗組比較，第4次訪視點聯合組檢測的CD3+CD4+、CD19+正常和異常差異有統計學意義(P<0.05)。CD3+代表人體細胞免疫功能狀態，CD4+是調控免疫反應最重要樞紐細胞，CD19+則與B細胞免疫相關。 從上述結果進一步證實聯合組不但能夠調節T細胞免疫，也可調控B細胞免疫。各組治療前后血小板抗體測定值組內或組間比較，差異無統計學意義(P>0.05)，其研究結果與何牧卿等[14]、Sakakura等[15]臨床研究結論相一致。該研究結果可以說明，調節免疫尤其是調節T細胞免疫可能是健脾益氣攝血顆粒治療ITP機制之一。但由于治療時間僅21天，尚不能按照ITP療效評定標準判定療效。同時，本研究中T細胞及其亞群以及血小板相關抗體觀察結果尚不能提供健脾益氣攝血顆粒具有明確調節免疫功能相關證據，有待于進一步開展臨床或基礎實驗進行彌補或輔助說明。