CVA10致手足口病的流行情況與疫苗研究進(jìn)展

高微捷 岳 磊 謝忠平

手足口病(hand，foot，and mouth disease，HFMD)是由多種腸道病毒引起的一類(lèi)常見(jiàn)的急性傳染病，多發(fā)生于5歲以下兒童，主要經(jīng)糞-口途徑傳播。感染某種腸道病毒而導(dǎo)致手足口病，無(wú)論是顯性感染還是隱性感染，都能夠獲得相對(duì)應(yīng)的特異性免疫力，且產(chǎn)生的抗體可在體內(nèi)存留較長(zhǎng)時(shí)間[1]。柯薩奇病毒A組10型(CVA10)是近幾年除EV71、CVA16和CVA6外，又一個(gè)引起全球范圍內(nèi)手足口病散發(fā)或暴發(fā)的病毒。日本、美國(guó)、新加坡、西班牙、芬蘭、印度、法國(guó)、泰國(guó)等國(guó)家，以及中國(guó)河北、山東、福建、湖北、河南、廣東等省份，均發(fā)生了不同程度的CVA10流行。筆者認(rèn)為應(yīng)該更加關(guān)注CVA10感染所致疾病以及CVA10疫苗的研制。

一、CVA10致手足口病的流行概況

1.CVA10致手足口病的臨床表現(xiàn)：不同病毒感染引起的手足口病臨床表現(xiàn)也略有差異。EV71感染的患兒臨床表現(xiàn)常累及神經(jīng)系統(tǒng)，同時(shí)還伴有嚴(yán)重的并發(fā)癥；CVA16感染的患兒臨床癥狀相對(duì)較輕，常為自限性疾病，預(yù)后較好，神經(jīng)系統(tǒng)受累較輕，但會(huì)有心肌受損出現(xiàn)；CVA6感染的患兒主要表現(xiàn)為發(fā)熱、皮疹和脫甲癥[2，3]。CVA10感染后，一般只引起輕度和自限性疾病癥狀，如發(fā)燒、口腔潰瘍、手腳上的皮疹或水皰疹等，也會(huì)發(fā)生如指甲脫落、皰疹性咽峽炎、甲狀腺腫瘤、神經(jīng)脊髓炎、腦膜炎、心肌炎等嚴(yán)重的手足口病并發(fā)癥，或者出現(xiàn)死亡[4]。曾有報(bào)道稱(chēng)，日本發(fā)現(xiàn)1例因患脊髓灰質(zhì)炎綜合征而死亡的患者，血清學(xué)鑒定為CVA10感染[5]。

2.CVA10致手足口病的流行病學(xué)概況：國(guó)外曾報(bào)道過(guò)CVA10感染而導(dǎo)致手足口病暴發(fā)的事件。2005年，日本愛(ài)知縣發(fā)現(xiàn)由腸道病毒引起的皰疹性咽峽炎病例64例，在對(duì)這些患者的糞便和咽拭子標(biāo)本進(jìn)行腸道病毒基因檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，病毒核酸陽(yáng)性率達(dá)46.9%(30/64)，進(jìn)一步的基因測(cè)序分析表明，在30份核酸陽(yáng)性標(biāo)本中，19份檢測(cè)為CVA10，占比63.3%。該研究結(jié)果表明，CVA10是導(dǎo)致2005年愛(ài)知縣皰疹性咽峽炎的主要病原體[6]。根據(jù)美國(guó)2006年的統(tǒng)計(jì)，CVA10血清型是最常報(bào)道的15種造成手足口病的腸道病毒血清型之一(第15位)，占比為1.4%[7]。2007年,日本神奈川縣從46份以皰疹性咽峽炎為主要癥狀的患者的咽拭子標(biāo)本中，分離出14 株CVA10分離株[8]。2008年，新加坡發(fā)生手足口病流行，經(jīng)檢測(cè)分析，由CVA10導(dǎo)致的手足口病占全部病例的11.8%[9]。2008年6月，西班牙瓦倫西亞發(fā)生手足口病疫情，被感染的患兒都不同程度地發(fā)生指甲脫落癥狀，并且從這些患兒的標(biāo)本中分離出CVA10，分離率為49%[10]。2008年秋季，芬蘭發(fā)生了全國(guó)性的手足口病疫情，相當(dāng)數(shù)量的臨床診斷患者為成年人，許多患者在手足口病急性期幾周后同樣也出現(xiàn)指甲脫落癥狀，在從患者標(biāo)本中分離病毒時(shí)發(fā)現(xiàn)，28%的致病原體為CVA10[11]。2009～2010年，印度檢測(cè)到CVA10的致病率為2.4%[12]。2010年4～12月份，法國(guó)出現(xiàn)手足口病，且CVA10的分離率為39.9%，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在4～7月份這段時(shí)間里，CVA10是分離最多的導(dǎo)致手足口病的病原體，達(dá)到了47.9%，患兒年齡集中在0～4歲[13]。2012年，在泰國(guó)發(fā)現(xiàn)的手足口病中，CVA10的分離率為1.1%[14]。詳見(jiàn)表1。

表1 CVA10致手足口病的國(guó)外流行病學(xué)概況

自2008年起，手足口病開(kāi)始在中國(guó)大部分地區(qū)流行，各地也均出現(xiàn)了關(guān)于CVA10感染發(fā)病的報(bào)道。2008～2009年，在對(duì)山東省760例手足口病患兒的臨床標(biāo)本進(jìn)行病毒分離和基因測(cè)序的過(guò)程中，共分離出330株病毒，其中10株為CVA10，分離率1.32%，基因進(jìn)化分析表明CVA10存在著兩個(gè)共同循環(huán)的基因型[15]。在對(duì)河南省、山東省、重慶市2009～2011年間發(fā)生的手足口病研究中發(fā)現(xiàn)，CVA10的流行季節(jié)為每年的4～8月份，并在5月份達(dá)到高峰(51.2%)，且多數(shù)患兒的年齡為25個(gè)月[16]。2010～2012年，廣州市收集到的樣本中，檢測(cè)到CVA10在8月份感染率達(dá)到高峰(4.3%)，年齡構(gòu)成在0歲組的感染率最高(3.7%)[17]。濟(jì)南市由CVA10引起手足口病的發(fā)生率分別為20.99%、11.69%和38.18%，感染季節(jié)為春季和夏季，秋季和初冬出現(xiàn)輕微高峰。感染年齡在1～2歲兒童中最常見(jiàn)(64.38%)，2歲時(shí)為高峰(42.47%)，且男女性別比例為1.52∶1[18]。石家莊市分別在2010年和2012年暴發(fā)了兩次由CVA10導(dǎo)致的手足口病，且2010年感染CVA10的流行率較高，5、6月份兩個(gè)月出現(xiàn)感染高峰，占實(shí)驗(yàn)室確診病例的4.7%。重要的是，在重癥當(dāng)中，CVA10感染占4.8%，是繼EV71血清型之后第2個(gè)引起嚴(yán)重手足口病的病原體[19]。2011～2012年在對(duì)阜陽(yáng)地區(qū)手足口病臨床實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程中，CVA10的檢出率為18.8%[20]。2012～2013年，上海市通過(guò)對(duì)手足口病患者的腸道病毒類(lèi)型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)感染CVA10占到7.5%，患兒男性∶女性為1.77∶1，年齡在0～3歲之間[21]。武漢市在此期間暴發(fā)手足口病，經(jīng)鑒定，CVA10是流行率最高的病原體(52.8%)，并在2013年4月取代EV71和CVA16，成為最主要的手足口病相關(guān)病原體[22]。2011～2014年，CVA10病例在福建省手足口病病原譜的年度構(gòu)成比分別為11.0%、6.0%、18.4%和9.2%[23]。2015年貴陽(yáng)市共收集到607份診斷為手足口病的標(biāo)本，其中檢測(cè)到CVA10陽(yáng)性病例71例(11.7%)，患兒的年齡多在3歲以下，以1～2歲為主，占病原體型別總數(shù)的30.99%(22/71)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CVA6+CVA10混合感染1例[24]。另外，廈門(mén)市CVA10感染率占手足口病病例的6.8%，占嚴(yán)重手足口病病例的38.9%。基于VP1基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，CVA10感染與嚴(yán)重手足口病病例的增加可能與廈門(mén)當(dāng)前流行毒株(進(jìn)化枝E)中一個(gè)新譜系(譜系A(chǔ))的出現(xiàn)有關(guān)，該菌株的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白中存在有5′UTR，它的4個(gè)核苷酸發(fā)生改變，5個(gè)氨基酸被取代。2016年，湖北省部分地區(qū)的CVA10陽(yáng)性檢出率為22.9%[25]。統(tǒng)計(jì)分析表明，2009、2010和2012年這3年，深圳市CVA10感染患者的平均年齡低于感染EV71的患者的平均年齡，這說(shuō)明CVA10感染人群可能逐漸幼齡化[26]。

雖然國(guó)內(nèi)有報(bào)道的CVA10感染流行時(shí)間晚于國(guó)外，但流行率逐年上升，流行范圍逐漸擴(kuò)大，人們的關(guān)注程度也越來(lái)越高。在手足口病暴發(fā)期間，除發(fā)現(xiàn)CVA10感染外，還檢測(cè)出CVA6、EV71和(或)CVA16的混合感染，這在很大程度上增加了手足口病的感染強(qiáng)度和病毒基因重組的概率。

3.CVA10致手足口病的基因分型概況：目前，國(guó)際上并沒(méi)有統(tǒng)一的CVA10基因分型標(biāo)準(zhǔn)，通常根據(jù)VP1或VP4基因的差異性來(lái)對(duì)毒株進(jìn)行分類(lèi)。

有報(bào)道稱(chēng)，中國(guó)大陸地區(qū)CVA10流行毒株的基因型以C型為主，從GenBank核苷酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索出2004～2016年間具有完整VP1基因核苷酸序列(894bp)的分離株273株，包括北京市、深圳市、石家莊市、山東省、長(zhǎng)沙市、云南省、安陽(yáng)市等中國(guó)大陸地區(qū)流行株218株；以及法國(guó)和美國(guó)等國(guó)外流行株55株[27]。通過(guò)一定方法對(duì)VP1基因核苷酸序列進(jìn)行分析，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，將CVA10毒株劃分為4個(gè)基因型(A～D型),其中B型和C型毒株均為中國(guó)大陸分離株，且有210株屬于C型分離株。還有研究者根據(jù)VP1基因的差異性≥15%，將CVA10毒株劃分為7個(gè)基因型(A～G型)[28]。2008～2012年間，深圳市60株CVA10菌株，除2株屬于基因型F(2009年被分離)外，其余均屬于基因型C[17]。2009～2012年間,石家莊市分離株有少數(shù)屬于基因型B，其余均為基因型C。

有研究者運(yùn)用最大似然法在VP4全基因(207bp)的基礎(chǔ)上構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，從武漢市2012～2013年的臨床標(biāo)本中分離出190株CVA10菌株，對(duì)其VP4基因進(jìn)行測(cè)序[22]。結(jié)果表明，其中187株CVA10菌株的核苷酸序列相同，另外3株CVA10菌株屬于另一個(gè)核苷酸序列，但它們?nèi)繉儆谙到y(tǒng)發(fā)育樹(shù)中的中國(guó)菌株的進(jìn)化枝。

CVA10基因分型需要一個(gè)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這樣不僅有利于流行病學(xué)的研究，同時(shí)對(duì)CVA10致手足口病疫苗的研發(fā)也至關(guān)重要。

二、CVA10致手足口病的預(yù)防性疫苗

CVA10疫苗的研發(fā)主要集中在滅活疫苗以及病毒樣顆粒疫苗等方面，目前均處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。

1.滅活疫苗：甲醛滅活或β-丙內(nèi)酯滅活的CVA10全病毒疫苗，可以在成年小鼠中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，在母體中獲得的中和抗體能夠傳遞給新生小鼠，提供免疫保護(hù)[4]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，甲醛滅活的全病毒CVA6和CVA10 2價(jià)疫苗，通過(guò)皮下注射可以誘導(dǎo)抗原特異性全身免疫應(yīng)答，不僅可以保護(hù)主動(dòng)免疫或被動(dòng)免疫的小鼠，還可以在母體中誘導(dǎo)高水平的中和抗體，并傳遞給新生小鼠。結(jié)果表明這兩種抗原之間在誘導(dǎo)病毒特異性免疫反應(yīng)方面沒(méi)有免疫干擾[29]。研究發(fā)現(xiàn)，用甲醛滅活的EV71、CVA6、CVA10和CVA16多價(jià)疫苗候選物的組合在小鼠和兔子免疫原性研究中均引發(fā)中和抗體應(yīng)答。用這種四價(jià)HFMD候選疫苗免疫的小鼠和兔子雖然觀察到有相互輕微的抗原干擾，但都產(chǎn)生了EV71、CVA6、CVA10和CVA16的抗血清[30]。這表明了利用甲醛滅活多價(jià)疫苗的可行性，但需要進(jìn)一步研究確定多價(jià)HFMD疫苗中各種抗原成分的最佳比例。有研究者通過(guò)比較在不同條件下，將甲醛或β-丙內(nèi)酯(BPL)對(duì)CVA10、CVA6和CVA16這3種病毒進(jìn)行滅活，發(fā)現(xiàn)CVA6用這兩種方法滅活后，可以誘導(dǎo)相似的免疫應(yīng)答；而CVA10和CVA16的免疫功效則是BPL滅活比甲醛滅活效果更好。研究發(fā)現(xiàn)，用BPL-滅活(BPL-inactivation，BI)的單價(jià)疫苗接種的小鼠，對(duì)異源菌株沒(méi)有足夠的交叉反應(yīng)性或交叉保護(hù)性；而用BI-3價(jià)接種的小鼠，誘導(dǎo)了足夠的中和抗體和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，表明了BI-CVA6、CVA10和CVA16是潛在的多價(jià)疫苗候選物[30]。

2.病毒樣顆粒疫苗：與滅活的全病毒疫苗方法比較，病毒樣顆粒(VLP)缺乏病毒核酸、復(fù)制和感染性，與其同源病毒的衣殼體相似，在形態(tài)上類(lèi)似于真正的病毒, 具有天然病毒的類(lèi)似嗜性，可以在重組表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生，能被細(xì)胞攝取并在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，激發(fā)全面免疫反應(yīng),用作疫苗非常安全。有研究曾分別在巴斯德畢赤酵母中產(chǎn)生了EV71、CVA16和CVA6的重組病毒樣顆粒(VLP)，并在臨床前研究中證明了它們能夠誘導(dǎo)針對(duì)小鼠被同源病毒攻擊的保護(hù)性免疫[29]。同樣，CVA10的重組病毒樣顆粒(VLP)也可以有效地誘導(dǎo)小鼠中的抗原特異性血清抗體，且抗VLP血清能夠有效地中和同源和異源性CVA10菌株，保護(hù)新生小鼠免于致死性CVA10感染。有研究發(fā)現(xiàn)，使用桿狀病毒-昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)分別產(chǎn)生EV71-VLP、CVA16-VLP、CVA6-VLP和CVA10-VLP，然后將這4種病毒樣顆粒(VLP)組合以配制4價(jià)VLP疫苗，并將4價(jià)VLP疫苗的免疫原性和保護(hù)效力與單價(jià)VLP疫苗進(jìn)行比較。小鼠免疫研究表明，四價(jià)疫苗可引發(fā)持久的血清抗體反應(yīng)，且被動(dòng)免疫的小鼠能夠針對(duì)EV71、CVA16、CVA10和CVA6病毒的單一或混合感染產(chǎn)生有效的保護(hù)。這為未來(lái)開(kāi)發(fā)手足口病多價(jià)疫苗提供了重要的信息和參考。

三、展 望

腸道病毒的感染嚴(yán)重影響兒童的健康。我國(guó)2008年后手足口病的持續(xù)高流行態(tài)勢(shì)以及2011年后手足口病病原譜的改變，造成手足口病的病毒類(lèi)型在逐漸發(fā)生著變化，對(duì)防控嚴(yán)重手足口病提出了新的挑戰(zhàn)。手足口病的發(fā)生由多種病原體導(dǎo)致，理想的疫苗應(yīng)能對(duì)多種病原體感染產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)間的保護(hù)。目前，正式投入市場(chǎng)的EV71型滅活疫苗，接種后可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗EV71的免疫力，用于預(yù)防EV71感染所致的手足口病。但它不能預(yù)防其他腸道病毒(包括CVA16、CVA6、CVA10等病毒)感染所致的手足口病。所以，進(jìn)一步研發(fā)單獨(dú)的CVA10疫苗，或研發(fā)EV71、CVA16、CVA6和CVA10多價(jià)疫苗，或研究不同病原體之間的共性，對(duì)研發(fā)廣譜高效疫苗具有重要意義。