RNAi沉默Galectin-1基因對HePG2肝癌細胞增殖、凋亡的影響

張暉漢 張有成 王哲元

Galectin-1在許多腫瘤中的表達水平上調，如星形細胞瘤、黑色素瘤、前列腺癌、膀胱癌、甲狀腺癌、結腸癌、卵巢癌等，并與其侵襲能力及惡性程度密切相關[1，2]。因此，筆者推測，Galectin-1在原發性肝癌的發生和侵襲轉移的過程同樣起重要作用。本研究用siRNA技術沉默人肝癌細胞系HePG2細胞株中Galectin-1基因的表達，從而觀察Galectin-1在肝細胞癌發生、發展中的作用。

材料與方法

1.主要材料與試劑:人肝癌細胞系HePG2細胞株購自四川醫學中心，BLOCK-iTTMAlexa Fluor Red Fluorescent Oligo，Lipofectamine RNAiMax，Opti-MEM Reduced Serum Medium購自美國Invitrogen公司，Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit購自立陶宛(MBI)Fermentas公司，PCR熒光定量試劑盒購自上海生工生物制品有限公司，Millicell小室購自美國Millipore公司。

2.siRNA的設計與合成：針對人Galectin-1 mRNA 的Stealth RNA由美國Invitrogen Inc設計并合成(編號為HSS106024、HSS106025、HSS106026)，并采用與Stealth RNA GC含量相當的中GC含量的陰性對照以排除脂質體轉染對細胞的影響。3條短雙鏈siRNA核苷酸序列分別為：HSS106024：正義鏈5′-UUGCUGUUGCACACGAUGGUGUUGG-3′，反義鏈5′-CCAACACCAUCGUGUGCAACAGCAA-3′，HSS106025：正義鏈5′-UGAUGCACACCUCUGCAACACUUCC-3′，反義鏈5′-GGAAGUGUUGCAGAGGUGUGCAUCA-3′，HSS106026：正義鏈5′-CACUCUCCAGGUUUGAGAUUCAGGU-3′，反義鏈5′-ACCUGAAUCUCAAACCUGGAGAGUG-3′。上述核苷酸序列在BLAST中進行對比確定只有Galectin-1 mRNA是其靶點。

3.細胞培養與轉染效率的確定：人肝癌細胞系HePG2在37℃，5%CO2恒溫細胞培養箱中培養，采用含10%標準胎牛血清，100μ/ml鏈霉素和青霉素的高糖DMEM培養基，細胞融合度達到70%左右的對數生長期細胞用于本實驗。本實驗采用脂質體lipofectamine RNAiMax轉染試劑盒將合成的Steslth RNA轉染至人肝癌細胞系HePG2，同時陰性對照用來避免非特異性寡核苷酸導入細胞內對細胞的影響。BLOCK-iTTMAlexa Fluor Red Fluorescent Oligo用來優化最佳siRNA與lipofectamine RNAiMax濃度比例及單細胞懸液濃度。將Lipofectamine RNAiMax與BLOCK-iTTMAlexa Fluor Red Fluorescent Oligo以不同濃度比例在細胞培養板內混勻，室溫下孵育30min，加入用10%標準胎牛血清無抗生素高糖DMEM培養基稀釋HePG2單細胞懸液，37℃，5%CO2恒溫細胞培養箱中培養24h后觀察轉染效率。每孔加入的細胞數在培養24h后細胞融合度達到30%～50%為宜。

4.RT-PCR檢測干擾效率：在6孔細胞培養板中用反向轉染的方法轉染人HePG2細胞2.5×105/ml，48h和72h后用UNlQ-10 柱式Trizol總RNA抽提試劑盒提取細胞總RNA，取樣進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外觀測燈下觀察28S、18S、5S 3個條帶，以確定提取的RNA的完整性。第一鏈cDNA反轉錄采用Revert AidTM First Strand cDNA Synthesis Kit，合成的cDNA在Roter Gene 6000熒光定量PCR儀上進行擴增，并分析結果。本實驗采用20μl反應體系，其中包括Premix 10μl，上下游引物各0.6μl，cDNA 2μl，DEPC水 6.8μl。β-actin作為內參照。PCR引物由上海生工合成，Galectin-1上游引物：5′- AACCTGGGCAAAGACAGCAACA-3′，下游引物：5′- GCGGTTGGGGAACTTGAATTCGTA -3′，β-actin上游引物：5′- GGAGATTACTGCCCTGGCTCCTA -3′，下游引物：5′- GACTCATCGTACTCCTGCTTGCTG -3′。最終擴增條件為：95℃變性15min，95℃ 15s，57℃ 30s，72℃ 45s，共40次循環，然后進行溶解曲線分析，以確定無非特異性擴增。每組樣品△Ct值計算方法為ΔCt = CtGalectin-1-Ctβ-actin， ΔΔCt=ΔCt實驗組-ΔCt空白對照組。最終實驗組相對于空白對照組Galectin-1 mRNA表達水平為 2-ΔΔCt。

5.流式細胞儀檢測凋亡：在50ml標準細胞培養瓶中轉染人HepG2細胞，48h后1000r/min離心5min收集上清液中懸浮細胞，預冷PBS沖洗兩次以除去殘留血清，0.25%胰酶消化貼壁細胞成單細胞懸液，計數105個細胞，1000r/min離心5min，保留0.5ml液體，加入預冷75%乙醇以固定細胞，4℃過夜，進行染色檢測。

6.MTT法檢測細胞增殖率：在96孔細胞培養板中反向轉染Stealth RNA及陰性對照48h，每孔加入5mg/ml MTT 20μl，37℃，5%CO2細胞培養箱中孵育4h，棄去上清液，加入DMSO 150μl，充分振蕩至結晶完全溶解，在酶標儀490nm波長處測吸光度值A490nm。每組平行設4個復孔，實驗重復3次。細胞增殖率計算方法為：實驗組細胞增殖率=實驗組平均A490nm/空白對照組平均A490nm×100%。

7.Millicell小室細胞遷移模型檢測腫瘤細胞遷移能力：Millicell小室上室加入300μl Opti-MEM無血清培養基室溫靜置30min，棄去上清以水化基質膠。在50ml標準細胞培養瓶中反向轉染人HePG2細胞48h后，0.25%胰酶消化離心收集細胞，PBS清洗兩次以除去血清的影響，Opti-MEM無血清培養基重懸細胞，調整濃度為5×105/ml。Millicell小室上室加入400μl單細胞懸液，24孔板下室內加入含15%新生牛血清高糖DMEM培養基500μl，37℃，5%CO2細胞培養箱中常規培養12h。棉簽擦去上室細胞，3%戊二醛固定，Giemsa染色，200倍倒置顯微鏡下計數中間及周邊5個視野穿透細胞數。每組平行設置3個復孔。遷移率=實驗組平均每視野透膜細胞數/空白對照組平均每視野透膜細胞數×100%。

結 果

1.轉染效率及優化條件：本項實驗采用BLOCK-iTTMAlexa Fluor Red Fluorescent Oligo用來優化最佳SiRNA與Lipofectamine RNAiMax濃度比例及單細胞懸液濃度。HepG2細胞在反向轉染24h后在熒光顯微鏡下計數紅色熒光信號的細胞并計算轉染效率。實驗表明，當Oligo終濃度為30nmol/L，單細胞懸液濃度為105/ml時，轉染效率可達到90%以上。因此，以后的實驗采用30nmol/L的siRNA和105/ml HePG2單細胞懸液為轉染條件，雞尾酒組(cocktail group)3條siRNA終濃度均為15nmol/L[3](圖1)。

圖1 HePG2紅色熒光標記寡核苷酸轉染效果圖A.普通光鏡視野下所見(×200);B.熒光顯微鏡同一視野下(×200)所見，可見90%以上細胞成功轉染，且細胞形態未見明顯改變

2.siRNA顯著下調Galectin-1基因在人HePG2細胞中的表達水平：采用實時定量RT-PCR檢測Stealth RNAi后人肝癌細胞系HePG2中Galectin-1 mRNA表達水平的變化。在β-actin mRNA表達水平相對穩定的條件下，RNA干擾后人HePG2細胞中Galectin-1 mRNA表達水平明顯下調。在3條不同序列Stealth RNA中，HSS106024對人HePG2細胞中Galectin-1 mRNA表達抑制作用明顯強于HSS106025、HSS106026，相比之下，雞尾酒組表現出最強抑制效果，同時陰性對照組未見明顯對Galectin-1 mRNA表達的抑制作用。數據分析顯示，HSS106024 轉染48h及72h后人HePG2細胞Galectin-1 mRNA表達水平分別為空白對照組的16.3%、12.8%，雞尾酒組轉染48h及72h后Galectin-1 mRNA表達水平分別為空白對照組的12.9%、10.3%，HSS106025及HSS106026轉染48h及72h后Galectin-1 mRNA表達水平分別為空白對照組的29.5%、21.6%和30.4%、37.4%。空白對照組與RNA干擾各組之間Galectin-1 mRNA表達水平差異有統計學意義(P<0.01)。干擾48h及72h對HepG2細胞Galectin-1 mRNA表達水平的抑制作用差異無統計學意義，因此后續實驗組采用干擾48h及雞尾酒組和HSS106024組為實驗條件(圖2)。

圖2 RNA干擾后各組Galectin-1 mRNA表達水平比較

3.siRNA抑制Galectin-1表達明顯誘導人肝癌細胞系HePG2凋亡：流式細胞儀分析結果顯示，采用RNA干擾技術抑制Galectin-1的表達可以明顯促進人肝癌細胞系HePG2的凋亡。其中雞尾酒組表現出最強的誘導HePG2細胞凋亡作用，細胞凋亡率達到31.4%，編號HSS106024 siRNA干擾組細胞凋亡率為22.5%，陰性對照組細胞凋亡率為1.6%，空白對照組未見明顯細胞凋亡(圖3)。

4.RNAi抑制Galectin-1表達可抑制人肝癌細胞系HePG2增殖：MTT法結果顯示，實驗組490nm波長處吸光度值A490nm明顯小于空白對照組和陰性對照組(P<0.01)，空白對照組和陰性對照組間比較差異無統計學意義(P>0.05)，HSS106024和雞尾酒組細胞增殖率分別為54.6%和54.0%(表1)。

5.RNAi抑制Galectin-1表達降低人肝癌細胞系HePG2遷移能力：Millicelll小室細胞遷移模型結果顯示，RNAi抑制Galectin-1在人肝癌細胞系HePG2中的表達可以明顯抑制腫瘤細胞的遷移能力，空白對照組及陰性對照組平均每高倍視野下透膜細胞數124.27±12.05，117.80±10.60明顯高于HSS106024和雞尾酒組65.00±5.53，63.33±5.72，實驗組與空白對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，陰性對照組與空白對照組比較，差異無統計學意義(表2)。

討 論

隨著對半乳糖凝集素家族成員研究的廣泛展開，其生物學活性，尤其在腫瘤發生、發展過程中的重要作用日益受到研究人員的重視[4]。Galctin-1作為半乳糖凝集素家族中的成員之一，廣泛存在于多種腫瘤組織和細胞中，并呈高表達狀態，通過細胞內信號傳導途徑參于腫瘤細胞發生、發展的各個過程，如腫瘤細胞的黏附、增殖、遷移、侵襲、凋亡等過程[2，5～9]。

圖3 RNA干擾48h后各組細胞凋亡率各組細胞轉染48h后，經PI(碘化丙啶)染色后流式細胞儀法檢測細胞凋亡，試劑盒采用Annexin V加PI的雙重染試劑盒

表1 RNA干擾48h后HePG2細胞增殖能力的比較

表2 RNA干擾48h后對HePG2細胞遷移能力的影響

兩獨立樣本t檢驗，與空白對照組比較，P<0.05

已有研究表明，Galectin-1在肝癌原發灶組織中表達水平明顯增高[10]。然而，Galectin-1在肝癌細胞中表達水平升高是否與肝癌的生物學行為有關尚不清楚。筆者推測Galectin-1可能參與了肝細胞癌的凋亡或侵襲過程。本研究設計了針對Galectin-1基因的siRNA，并將后者用于肝細胞癌HePG2的Galectin-1的沉默，結果表明，用siRNA轉染并沉默Galectin-1基因的表達(89.7%)是完全可行的。說明通過RNA干擾技術可以探索Galectin-1在肝癌發生、發展中所發揮的作用。

根據本研究結果，人肝癌細胞系HePG2在轉染了針對Galectin-1 mRNA 的短雙鏈siRNA后，其細胞內Galectin-1 mRNA表達明顯受到抑制，且HePG2細胞的凋亡明顯增加。Galectin-1能夠激活Ras，是Ras信號途徑的一個調節因子，而Ras的激活可以導致細胞增殖、衰老和死亡等不同的生物學效應。另外，關于肝細胞性肝癌細胞系(HePG2)的體外研究證實，Galectin-1有助于促進肝細胞性肝癌中上皮間質轉化的過程，TCF4/LEF1轉錄因子的調節被認為可能與這一作用有關[11]。因此，Galectin-1對腫瘤細胞的凋亡可能存在雙向調節作用，其機制有待于進一步研究。

筆者還觀察到，RNA干擾技術抑制人肝癌細胞系HePG2細胞中Galectin-1 mRNA表達后，其增殖和遷移能力同時受到抑制。在宮頸癌中，Kim等研究發現，應用反義mRNA或siRNA抑制Galectin-1的活性可顯著抑制腫瘤細胞的增殖。Toussaint等[12]關于Galectin-1的體外實驗表明，它可以增強膠質母細胞瘤的遷移和侵襲能力，而患者Galectin-1高表達者也更易浸潤、預后更差。因此，推測內源性Galectin-1可能具有促進細胞增殖活性的作用。研究表明，在腦神經膠質瘤腫瘤微環境中，Galectin-1可以促進髓系來源抑制細胞的蓄積以及促血管生成環境的形成[13]。研究還表明，Galectin-1可能參與腫瘤轉移的細胞黏附、聚集、新生血管形成等多個過程。半乳糖凝集素家族可以和細胞膜表面參與信號識別的半乳糖苷結合，它們可能通過此途徑調節相鄰腫瘤細胞間或腫瘤細胞與細胞外基質間的黏附能力；Galectin-1可以增加前列腺癌和卵巢癌細胞系與細胞外基質間的黏附能力[14，15]。Jouve等[16]研究表明，Galectin-1可以介導胃癌內皮細胞凋亡的調節。Laderach等[15]的體外實驗證明Galectin-1在與腫瘤相關的微血管中上調，并且可以調節腫瘤與與血管內皮細胞間的相互作用。另外，有研究表明，抗血管內皮生長因子可以用于治療腫瘤，主要是是通過促進腫瘤細胞分泌Galectin-1，炎性因子及低氧環境可促進這一過程的發生。因此可以認為，Galectin-1可能是參與腫瘤新生血管形成的一個重要因素。

綜上所述，利用RNA干擾技術抑制人肝癌細胞系HePG2Galectin-1 基因的表達，可以顯著促進腫瘤細胞發生凋亡，同時抑制腫瘤細胞的增殖和遷移能力。鑒于Galectin-1在多種腫瘤組織或細胞中高表達，并且在腫瘤生長和轉移過程中起重要作用，使其可能成為多種腫瘤分子靶向治療的一個新靶點。