小鼠子宮內膜表面蛋白的二維電泳研究

葉天民 彭鼎佳 肖 佳 楊樹標

不孕癥是當今困擾人類生殖繁衍的一大問題。雖然目前已經擁有了體外受精等輔助生殖技術，且適宜著床的內膜、優質胚胎的選擇等問題均已得到解決，但臨床上許多胚胎移植以后仍然難以成功妊娠。其中的主要癥結之一在于胚胎的著床問題。而不管對人類還是哺乳動物而言，著床是在一定的時間才能發生的，這段時間稱之為著床窗。對人類而言，子宮內膜上皮細胞對于胚胎處于開放接受狀態的時間僅在著床窗那幾天，一般認為是在排卵后的6～10天。對小鼠而言，著床窗一般在排卵后的4～5天。一旦錯過了這個時間，著床將不能發生。

哺乳動物的生殖過程中，胚胎著床是一個非常重要的事件。而且在哺乳動物的不同物種之間，著床的幾個基本的步驟都是非常類似的，主要包括定位、黏著和侵入。定位指囊胚于內膜表面不穩定的黏著。此后，黏著步驟指囊胚滋養細胞開始具有黏著能力并黏于子宮內膜表面。接下來滋養細胞穿破內膜腔上皮層，侵入內膜的間質，即侵入過程。這些步驟是在母體甾體性激素的調控下完成的，并且需要胚胎和子宮之間和諧而精密的對話。該系列對話是由諸多分子通路所介導的，包括性激素、細胞因子、生長因子、黏著分子和脂質等[1]。而在子宮內膜腔上皮處于對胚胎接受的著床窗時，上皮細胞的基膜、橋粒、細胞骨架及細胞質會發生改變和變化。所以筆者預測子宮腔上皮細胞表面的一些蛋白對于胚胎的定位和黏著是非常至關重要的。

蛋白質組學技術是目前一項研究蛋白質有效而常用的方法。在筆者的研究中，并沒有將整塊子宮內膜組織消化和蛋白提取處理后進行分析，而是瞄準了腔上皮細胞表面的蛋白質進行蛋白質組學的研究；因為，著床的早期階段就是在腔上皮表面發生。在本研究中，筆者將孕第1天(不接受胚胎階段)及孕第4天(接受胚胎階段)的小鼠腔上皮表面進行了生物素結合標記，然后提取表面蛋白后進行二維電泳及質譜分析。最后再進行免疫組化學驗證。

材料與方法

1.生物素標記小鼠子宮內膜腔上皮表面：本研究所有健康雌性及雄性ICR和GFP小鼠由香港大學實驗動物中心提供。所有實驗均得到香港大學實驗動物倫理學委員會批準。將成年6～8周ICR雌性小鼠分別與正常雄性及行輸精管結扎術后的絕育雄性小鼠放在同一籠中過夜。第2天檢查雌性小鼠的陰道是否有白色精液栓。有栓的小鼠視為成功交配，此天為孕第1天或者假孕第1天。將與絕育雄鼠交配后假孕第1天及與正常雄性小鼠交配后孕第4天的ICR小鼠進行麻醉。行開腹手術，暴露子宮，每側宮角處注射25μl生物素標志物(0.25mg/ml，美國Thermo公司)，關腹腔縫合后放回籠內。1h后，將小鼠處死，取出子宮后用眼科鑷分離出子宮內膜后用磷酸緩沖液(PBS)沖洗3次。

2.生物素標記蛋白的純化提取：分離出的小鼠子宮內膜組織，用液氮處理后搗碎，用生物素標記表面蛋白提取試劑盒(美國Thermo Scientific公司)中的裂解液溶解，離心后取上清液。根據試劑盒的實驗步驟提取目標蛋白質，進行后續的二維電泳。

3.二維雙向電泳及質譜分析：二維電泳參考其他文獻的方法[2]。第一維電泳時每次上樣量為30μg，膠條為7cm IPG膠(非線性，pH值3～10，美國Bio-Red公司)，之后第二維電泳用12.5%的SDS-PAGE膠進行分離，每一組均用5個樣本進行二維電泳。然后進行標準銀染。膠樣用ImageScan的掃描儀(美國Amersham Biosciences公司)進行高清掃描，得到的圖片運用Image Master 2D Elite 4.01軟件(美國Amersham Biosciences公司)進行對比分析。經過軟件標準化分析后，有差異表達的蛋白對應的膠上的點用刀片切出后進行質譜分析[3]。

4.免疫組化：小鼠內膜組織經過固定、石蠟包埋之后，進行常規石蠟切片制片。切片上組織厚度為5μm。切片經脫蠟后進行處理。GFP小鼠囊胚組內膜直接加上羊抗兔二抗(1∶500)(丹麥Dako公司)處理0.5h，然后用ABC(生物素-辣根過氧化物酶)處理，最后用DAB顯色。其他組織切片則用傳統免疫組化的抗原修復、過氧化氫處理，加一抗(1∶100)、二抗(1∶500)后用ABC+DAB法顯色。其中一抗為兔抗鼠APN和intergrin β1(美國Santa Cruz公司)，二抗為羊抗兔IgG(丹麥Dako公司)。

結 果

1.標記不接受胚胎階段及接受胚胎階段小鼠子宮內膜表面蛋白:圖1為進行免疫組化染色后的小鼠子宮內膜組織切片，被生物素標記的子宮內膜表面有染色，而對照組未見染色。

2.不接受胚胎階段及接受胚胎階段小鼠子宮內膜表面蛋白的二維電泳:將生物素標記的小鼠子宮內膜腔表面蛋白進行分離純化后，進行了二位電泳，圖2為兩個不同階段小鼠子宮內膜表面蛋白二維電泳膠的掃描圖。通過Imagemaster軟件進行分析后，筆者共發現了47個差異表達超過2倍的蛋白，其中接受胚胎階段高表達蛋白29個，不接受胚胎階段高表達蛋白18個；在這里面發現20個差異表達超過3倍的蛋白，其中接受胚胎階段高表達蛋白13個，不接受胚胎階段高表達蛋白7個(表1)。圖3顯示了其中部分差異表達蛋白的放大膠點圖。

圖1 生物素免疫組化染色后的小鼠內膜組織學圖像(×200)A.經生物素標記后孕第1天小鼠子宮內膜組織中的免疫染色； B. 經生物素標記后孕第4天小鼠子宮內膜組織中的免疫染色；C.對照組，未經生物素標記的小鼠子宮內膜組織；LE.腔上皮；GE.腺上皮；SC.間質細胞

圖2 孕第1天和第4天小鼠子宮內膜腔上皮表面蛋白二維電泳膠掃描圖小鼠子宮內膜腔上皮表面蛋白經過抽提和純化后第一維用pH值3～10的IPG膠條進行等電聚焦，第二維用SDS-PAGE膠進行電泳，膠進行銀染顯色A.孕第1天;B.孕第4天

3.差異表達蛋白的質譜分析：將二維電泳中發現的差異表達蛋白進行切膠后提取純化，并進行質譜分析，差異表達超過3倍的蛋白質，詳見表1。

4.部分差異表達蛋白的免疫組化染色:為了驗證二維電泳發現差異表達蛋白的結果，檢測子宮內膜組織的intergrin β1和AP-N的表達，筆者對孕第1天和孕第4天的小鼠子宮內膜組織切片進行免疫組化染色。intergrin β1在孕第1天小鼠子宮內膜表面的表達明顯高于孕第4天小鼠(圖3A、B)，AP-N在孕第4天小鼠子宮內膜表面的表達明顯高于孕第1天小鼠(圖3C、D)，這些結果與二維電泳中發現的結果一致。

討 論

到目前為止，胚胎的滋養層是如何黏著于可接受胚胎狀態子宮內膜并進而完成著床尚不明確。近些年，一些比較蛋白質組學研究運用于小鼠或人類子宮內膜組織的著床相關蛋白的發現和研究[10, 21～24]。這些研究都是對子宮內膜組織的全部細胞蛋白質組學的研究。在筆者的研究中，集中發現了子宮內膜腔上皮細胞表面蛋白的差異表達，這樣降低了其他蛋白的信息干擾，集中發現與胚胎黏著有關的蛋白。

表1 不接受胚胎階段及接受胚胎階段小鼠子宮內膜表面差異蛋白列表

圖3 差異表達蛋白中intergrin β1和AP-N組織學圖像(×400)A.intergrin β1孕第1天小鼠子宮內膜組織中的表達； B.intergrin β1孕第4天小鼠子宮內膜組織中的表達；C. AP-N孕第1天小鼠子宮內膜組織中的表達；D. AP-N孕第4天小鼠子宮內膜組織中的表達;LE.腔上皮；GE.腺上皮；SC.間質細胞

為了發現和胚胎黏著相關的蛋白，選取接受胚胎階段和不接受胚胎階段的內膜的子宮內膜腔上皮細胞進行蛋白質組學比較。其中的表面蛋白用生物素進行了標記。而且這種標記是不可穿透性的。只有細胞表面的蛋白才會被標記，并且用免疫染色進行了確認，在圖1A和B的子宮內膜表面可以見到一層標志物生物素的染色。對于生物素的濃度和作用時間都進行了預實驗(這部分數據沒有展示)。筆者發現30min的標記時間和0.25mg/ml 的生物素濃度可以得到最佳的效果。因為如果用過大的生物素濃度或者過長的標記時間都會見到內膜間質部出現生物素的蹤跡。一般4～5只小鼠的標記蛋白足夠用于一個樣本的后續實驗。

經過抽提純化后的蛋白通過二維電泳進行分離比較。經過ImageMaster軟件的分析，筆者發現了在接受胚胎階段有12個蛋白高表達，在不接受胚胎階段有7個蛋白高表達(均>2倍的表達水平)。初步看來蛋白酶活性抑制劑相關蛋白表達升高，可能與滋養細胞侵入階段溶解相關細胞有關。因為滋養細胞侵入和腫瘤的浸潤不完全相同，滋養細胞的侵入需要調控侵入時溶解細胞的數量和深度有關。因為，沒有控制的滋養細胞侵入和胎盤植入有相關性。這方面的蛋白在孕期豬的子宮內膜也有明顯表達。kininogen-1是硫基蛋白酶抑制劑，此蛋白酶在人類胚胎著床中功能激活[13]。類似的alpha-1-antitrypsin 1-2也是分泌性蛋白酶抑制劑，在水牛的早期胚胎著床階段有高表達[4]。alpha-2-macroglobulin是一個廣譜的蛋白酶抑制劑，和小鼠胚胎著床前定位有關[25]。在差異表達的蛋白中，已經有研究報道過vitronectin和胚胎著床的有關，它是integrin αvβ3的配體，后者是囊胚黏著階段的重要相關蛋白，也是內膜容受性的重要標記[15]。在小鼠著床中，如果integrin受體被阻斷，著床點的數量會顯著減少[26]。Annexin A2也是曾經報道過的胚胎著床相關蛋白，在人類子宮內膜中，annexin A2在內膜接受胚胎著床期高表達而在接受胚胎著床的前期為低表達；這些結果說明annexin A2在胚胎著床中有相關的功能作用[14]。近年來，annexin A2在生殖領域的研究在不斷深入。目前發現，annexin A2在胚胎著床中的作用是通過RhoA的激活和蛋白的調節而產生的[27]。

在不接受胚胎的階段發現的高表達蛋白中,很多都是與免疫活性和細胞結構有關。其中有些蛋白如mucin-4和spectrin beta-chain在異位妊娠女性的子宮內膜中有高表達[17]。mucin-4是mucin家族中的一員，是細胞黏附的抑制劑，它在子宮內膜上皮表面的缺失是囊胚黏著的重要前提[28]。而且mucin-4的表達下調是受到性激素調控的[29]。其他蛋白在此階段的表達已經有相關文獻報道過。例如，collagen alpha-1 (Ⅵ) chain在胚胎著床前和著床后均有高表達。

綜上所述，筆者通過生物素標記小鼠子宮內膜腔上皮表面，并聯合二維電泳發現了一些在接受胚胎著床階段和不接受胚胎階段差異表達的表面蛋白，并發現了一些和胚胎著床相關的重要蛋白。