白香丹膠囊對PMDD肝氣逆證模型大鼠血清抗焦慮樣作用機制研究

王 帥 郜彥鑫 張 洪 付曉杰 劉金虎 張 浩 王杰瓊 宋春紅

經前煩躁障礙癥(premenstrual dysphoric disorder, PMDD)，是指女性月經來臨前一周反復出現的一系列情感、軀體及社會人際交往方面的綜合癥狀，具有月經來臨后癥狀減輕月經結束后癥狀消失的特點，是經前期綜合征(premenstrual syndrome, PMS)的嚴重亞型之一[1]。PMDD肝氣逆證作為PMDD的主要證候之一，除具有PMDD的一般癥狀外，主要表現為急躁易怒、小腹墜脹、焦慮、心煩等癥狀，極大地影響女性的正常經期生活[2，3]。近年來，大量國內外相關研究表明，PMDD肝氣逆證的發生可能與患者體內雌、孕激素及抑制性氨基酸神經遞質γ-氨基丁酸的表達異常有關。實驗室前期動物實驗研究表明，白香丹膠囊能提高PMDD肝氣逆證大鼠的行為學得分，但其作用機制尚待深入研究[4]。本研究在實驗室前期行為學評價的基礎上，進一步檢測給藥后大鼠血清中孕酮(P)、四氫孕酮(ALLO)、γ-氨基丁酸(GABA)的含量變化，研究白香丹膠囊對PMDD肝氣逆證模型大鼠血清中P、ALLO、GABA的影響，進一步明確白香丹膠囊對PMDD肝氣逆證在血清中的具體作用機制，為臨床應用及進一步的機制研究奠定基礎。

材料與方法

1.實驗動物:SPF級雌性健康未孕Wistar大鼠，體質量135±15g，200只，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，動物合格證編號：SCXK(京)2018-0001。實驗前適應性飼養7天，每天正常抓握所有大鼠，每次每只大鼠抓握時間不少于5min。飼養環境恒溫23±3℃，恒濕60%±5%RH，晝夜顛倒(12h/12h)每天22:00時開燈、次日8:00時關燈，食物和水正常攝取。所有操作均在≤25lx的暗淡紅色燈光下進行。

2.儀器與試劑：電子天平(ZA102R4，德國賽多利斯集團)；大鼠受孕期分析儀(MK-11，日本Muromachi)；SuperMaze動物行為分析系統(上海欣軟信息科技有限公司)；大鼠高架十字迷宮實驗箱體(上海欣軟信息科技有限公司)；大鼠曠場實驗箱體(上海欣軟信息科技有限公司)；水合氯醛(國藥集團化學試劑有限公司)；青霉素(山東魯抗醫藥股份有限公司；批號：140602)；白香丹膠囊(山東中醫藥大學天然藥物實驗室制；批號：20171030)；鹽酸氟西汀分散片(常州四藥制藥有限公司；批號H20170462)；孕酮ELISA檢測試劑盒(武漢華美生物科技有限公司；產品編號：C013218011)；四氫孕酮ELISA檢測試劑盒(武漢伊艾博科技有限公司；產品編號：8A296J)；γ-氨基丁酸ELISA檢測試劑盒(武漢基因美生物科技有限公司；產品編號：GR201801-1)。

3.居住入侵法制備PMDD肝氣逆證模型大鼠：(1)實驗大鼠動情周期的確定：根據大鼠受孕期分析儀來判斷雌性大鼠動情周期：陰道電阻值≥3Kohm的雌性大鼠處于接受期(約1天)，陰道電阻值<3Kohm的雌性大鼠處于非接受期(約3天)，動情周期規律的大鼠符合一定的規律，即一個動情周期(約4天)的電阻值變化為高、低、低、低。將連續兩個動情周期(約8天)陰道電阻值變化符合上述規律的雌性大鼠作為動情周期規律大鼠。(2)居住入侵誘導實驗：動情周期規律大鼠作為實驗的居住鼠，動情周期不規律大鼠作為實驗的入侵鼠，并對入侵鼠行雙側卵巢摘除手術，手術恢復14天，待其痊愈后，進行居住入侵誘導實驗。晝夜顛倒后在14:30～17:30時大鼠處于夜間興奮狀態，因此每天實驗時間均為該時間段，并在居住鼠飼養環境中進行。對居住鼠進行連續4天(一個完整動情周期)的居住入侵誘導實驗。待所有居住鼠居住入侵實驗結束后，采用盲法對實驗過程進行評定。

4.實驗動物分組及給藥：居住入侵實驗結束后，根據各居住鼠的行為測試得分高低排列。將得分前75%的大鼠平均分為3組，即PMDD肝氣逆證模型組(Model)、白香丹膠囊干預組(BXD)和鹽酸氟西汀分散片干預組(FXT)，并將得分后25%的大鼠作為空白對照組(Control)。于每日8：30時按1ml/100g灌胃給藥，連續給藥28天。BXD組大鼠給予白香丹膠囊，給藥量為0.2g/(kg·d)；FXT組大鼠給予鹽酸氟西汀分散片，給藥量為2.7mg/(kg·d)；模型組及正常組大鼠給予同等體積的純水。

5.行為學評價:行為學評價于非接受期進行，末次給藥1h后進行攻擊行為測試、曠場實驗和高架十字迷宮實驗。采用攻擊行為測試來評價大鼠給藥后激怒行為，采用曠場實驗和高架十字迷宮實驗來評價大鼠的焦慮樣行為。(1)攻擊行為測試:對所有的居住鼠進行4天(一個完整動情周期)的攻擊行為測試，具體方法同居住入侵誘導實驗。(2)曠場實驗：于大鼠的夜間進行，具體方法為輕捏待測大鼠頸背部皮膚并將其置于黑色的曠場箱(規格：50cm×50cm×40cm)的中央，用Supermaze 3.0動物行為分析系統記錄、跟蹤待測大鼠6min內的自由活動行為。觀察的指標包括總路程、中央區停留的總時間。為避免大鼠間氣味的相互干擾，每只大鼠測定結束后應用乙醇將曠場箱擦拭干凈后，再進行下一只老鼠的檢測。(3)高架十字迷宮實驗：待測大鼠跑完曠場實驗后，輕捏其頸背部皮膚并將其放于十字高架迷宮的中央區，且保證大鼠頭部朝向任一開臂并允許其自由探索。用Supermaze 3.0動物行為分析系統記錄、跟蹤大鼠5min內自由活動行為。觀察的指標包括進入兩開臂的次數(OE)、進入兩開臂的時間(OT)、進入兩封臂的次數(CE)、進入兩封臂的時間(CT)。

6.取材并檢測：生殖內分泌激素的測定于待測大鼠全部完成行為學評價后(確保待測大鼠此時仍處于非接受期)，10%水合氯醛(35mg/kg)腹腔麻醉，大鼠腹主動脈取血，血樣靜置30min后3500r/min離心10min，將離心后的上層血清轉移至EP管中。采用ELISA法分別測定各組大鼠血清中P、ALLO、GABA的含量，操作按試劑盒說明書進行。

結 果

1.攻擊行為測試:與正常組大鼠比較，模型組大鼠攻擊行為明顯增加(P<0.01)；與模型組大鼠比較，FXT組大鼠和BXD組大鼠的攻擊行為均明顯減小(P<0.01)，詳見圖1。

圖1 各組大鼠攻擊行為測試得分與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

2.曠場實驗：與正常組比較，模型組大鼠總路程增加(P<0.01)，而在中央區停留的總時間減少(P<0.01)；與模型組比較，FXT組和BXD組大鼠總路程均明顯減少(P<0.01)，而在中央區停留的總時間均明顯增加(P<0.01)；與FXT組比較，BXD組大鼠總路程稍有增加，在中央區停留的總時間也稍有增加，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖2。

圖2 各組大鼠曠場實驗得分與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

3.高架十字迷宮實驗：與正常組比較，模型組大鼠進入開放臂的次數百分比和時間百分比均明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，FXT組和BXD組大鼠進入開放臂的次數百分比和時間百分比均明顯增加(P<0.01)；與FXT組比較，BXD組大鼠進入開放臂的次數百分比和時間百分比均略有增加，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖 3。

4.血清中指標檢測:與正常組比較，模型組大鼠血清中P水平顯著下降(P<0.05)，ALLO水平顯著下降(P<0.05)，GABA水平顯著下降(P<0.05)；與模型組比較，FXT組和BXD組大鼠血清中P水平均顯著上升(P<0.05)，ALLO水平均顯著上升(P<0.05)，GABA水平顯著上升(P<0.05)；與FXT組比較，BXD組大鼠血清中P水平略有上升，ALLO水平略有下降，GABA水平略有下降，差異無統計學意義(P>0.05)，詳見圖4及表1。

圖3 各組大鼠高架十字迷宮實驗得分與正常組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

圖4 各組大鼠血清指標水平與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

組別n給藥量孕酮(ng/ml)四氫孕酮(ng/ml)γ-氨基丁酸(ng/ml)正常組12相等劑量47.11±3.2268.975±0.525147.11±3.226模型組12相等劑量19.56±2.359?6.497±0.1135?19.56±2.359?氟西汀組122.7mg/(kg·d)34.28±2.840#8.130±0.1895#34.28±2.840#白香丹組120.2g/(kg·d)38.14±4.029#7.863±0.3330#38.14±4.029#

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

討 論

PMDD肝氣逆證作為PMDD的亞型之一，突出表現為急躁易怒、心煩、焦慮、小腹墜脹等癥狀，嚴重損害了女性的身心健康，給社會帶來了沉重負擔。近年來有關PMDD肝氣逆證的發病機制研究逐漸深入，越來越多的研究表明該疾病的發病機制與機體某些調節激素及神經遞質的水平異常有關。

大量研究發現，性激素水平改變與女性情緒密切相關[5]。PMDD與卵巢黃體分泌的孕酮關系密切[6]。喬明琦等[7]研究證實PMDD肝氣逆證患者E2、P卵泡期分泌峰的低水平與黃體期分泌峰的闕如，推測其是 PMDD 肝氣逆證微觀機制之一，這與筆者研究結果一致，PMDD肝氣逆證模型大鼠血清中P含量明顯降低，藥物干預后明顯增加，行為學癥狀得以改善，血清中P含量明顯增加。表明模型大鼠體內P含量的紊亂是誘發PMDD肝氣逆證發生的重要機制，白香丹膠囊可以通過提高模型大鼠體內P的含量來發揮作用。ALLO作為另一類重要的神經類固醇，被認為是強效GABAA受體激動劑，其血清水平能夠反映月經周期的孕酮變化[8，9]。

Schüle等[10]研究表明，減少ALLO在外周血或腦脊液水平與焦慮癥、嚴重抑郁癥、經前焦慮障礙或攻擊行為密切相關，ALLO降低會誘發焦慮癥狀的出現，癥狀改善后其含量會有所增加，這與本研究結果一致，模型大鼠血清中ALLO含量呈現大致相同的變化，模型組大鼠與對照組比較，ALLO水平顯著性下降，經過白香丹膠囊治療后，其ALLO水平顯著增加。也與ALLO在實驗動物身上體現出麻醉和抗焦慮特性的研究一致[11，12]。但也有研究證明ALLO水平降低對個體是有益的，可能是因為ALLO在杏仁核反應中存在雙峰效應有關[13]。對于PMDD患者與正常對照組ALLO血清水平存在一定差異的結論，有待于進一步研究[14]。

γ-氨基丁酸(GABA)是已知重要的抑制性神經遞質，有抑制攻擊性行為的作用。調查顯示有攻擊性傾向的人，外周血與攻擊性史呈負相關[15]。研究證實，GABA可以有效抑制HPA軸功能亢進，進行負反饋調節，改善情緒障礙類疾病，當焦慮癥狀出現時GABA含量顯著性下降[16]。本研究中模型大鼠血清中GABA含量顯著性下降，給予白香丹膠囊后，血清中GABA含量明顯增加，與對照組GABA水平比較，差異無統計學意義。馮玉等[17]研究證實，白香丹膠囊通過提高GABA的水平而對PMS肝氣逆證大鼠血清和大腦皮質神經中樞有一定的抑制作用。可知GABA水平異常是PMDD 肝氣逆證的重要病理機制，也是白香丹膠囊的重要作用靶點。

綜上所述，本研究證實白香丹膠囊可提高PMDD肝氣逆證模型大鼠血清中P、ALLO、GABA水平，為探究PMDD肝氣逆證模型大鼠腦區發病機制的研究奠定了基礎。由此推測PMDD肝氣逆證的發病可能與機體中樞系統中上述指標的含量下降有關，而白香丹膠囊可以通過提升P、GABA、ALLO的水平發揮治療作用。由于技術水平有限，本研究未能深入探討其在腦區的水平差異，有待于在今后開展的研究中證實。