USP14在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及臨床意義

韓秋月 章 霞 章文龍 張堅(jiān)剛 周文君 林愛(ài)芬

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)惡性腫瘤之一，男性發(fā)生率居第三位，女性發(fā)生率居第二位[1]。近年來(lái)，結(jié)直腸癌治療已經(jīng)取得重大進(jìn)展，但治愈率和長(zhǎng)期生存率幾乎沒(méi)有變化，仍存在諸多問(wèn)題，如早期診斷缺乏特異性標(biāo)志物、轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)高、缺乏有效治療的特異性靶點(diǎn)等[2]。泛素特異性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14，USP14)由494個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約為56 kDa，主要分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜[3]。USP14含有一個(gè)N端UBL結(jié)構(gòu)域，與USP14和蛋白酶體之間的結(jié)合有關(guān)[4]。本研究利用免疫組化法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織中USP14表達(dá)情況及分析其與臨床病理參數(shù)的相關(guān)性，進(jìn)一步分析USP14與結(jié)直腸癌患者預(yù)后關(guān)系，探討USP14在結(jié)直腸癌中的作用。

材料與方法

1.標(biāo)本收集：選取2005年9月～2011年8月浙江省臺(tái)州醫(yī)院確診并行結(jié)直腸癌根治術(shù)患者腫瘤組織樣本225例及對(duì)應(yīng)的正常組織225例，經(jīng)石蠟包埋后儲(chǔ)存于浙江省臺(tái)州醫(yī)院生物資源中心。其中，男性122例，女性103例，患者年齡28～90歲，平均年齡63歲。病理分期按AJCC第7版制定的TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期126例，Ⅲ～Ⅳ期99例。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行放化療、藥物等治療。所有標(biāo)本均已取得患者知情同意，并通過(guò)浙江省臺(tái)州醫(yī)院倫理學(xué)委員會(huì)審核。

2.主要試劑和方法：兔抗人多克隆抗體USP14購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，采用免疫組化法檢測(cè)結(jié)直腸癌組織及對(duì)應(yīng)遠(yuǎn)端正常組織中USP14表達(dá)情況。切片后，60℃烘烤過(guò)夜，二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化。3%過(guò)氧化氫孵育15min，0.01mol/L枸櫞酸鹽(pH值6.0)高壓熱修復(fù)。1%BSA封閉非特異性抗原，USP14抗體4℃孵育過(guò)夜，過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗兔第二抗體37℃孵育30min。DAB顯色，蘇木精復(fù)染。梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，閱片。其中，肺癌組織作為陽(yáng)性對(duì)照，TBS溶液替代USP14抗體作為實(shí)驗(yàn)陰性對(duì)照。

3.判斷標(biāo)準(zhǔn)：免疫組化結(jié)果分別由兩名病理科醫(yī)生進(jìn)行閱片。以淡黃色至棕黃色染色為陽(yáng)性，結(jié)果按照陽(yáng)性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分。隨機(jī)選擇10個(gè)高倍鏡視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)。陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<5%為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥5%為陽(yáng)性。

4.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用χ2檢驗(yàn)分析USP14表達(dá)和臨床病理參數(shù)相關(guān)性，Kaplan-Meier法用于生存分析，COX回歸模型用于多因素分析,以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1. 結(jié)直腸癌組織中USP14的表達(dá)情況：USP14表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(圖1)。結(jié)直腸癌組織中USP14表達(dá)率為67.6%(152/225)，正常組織中表達(dá)率為42.2%(95/225)。結(jié)直腸癌組織中USP14表達(dá)顯著高于正常組織(χ2=11.62，P<0.05)。

圖1 結(jié)直腸癌組織USP14表達(dá)結(jié)果(免疫組化，×400)A.結(jié)直腸癌組織陽(yáng)性表達(dá)；B.結(jié)直腸癌組織陰性表達(dá)；C.正常組織陽(yáng)性表達(dá)；D.正常組織陰性表達(dá)

2.USP14表達(dá)和臨床病理參數(shù)相關(guān)性：USP14表達(dá)與臨床病理參數(shù)分析表明，其與性別(χ2=0.205，P=0.651)、年齡(χ2=1.274，P=0.259)、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移(χ2=0.739，P=0.390)、TNM分期(χ2=3.082，P=0.079)均無(wú)顯著相關(guān)性(表1)。

表1 USP14表達(dá)與臨床病理參數(shù)相關(guān)性

3.USP14表達(dá)與結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)系：225例結(jié)直腸癌患者進(jìn)行生存分析表明，USP14表達(dá)陽(yáng)性患者的平均生存時(shí)間63.78個(gè)月(95% CI：57.37～70.19個(gè)月)，USP14表達(dá)陰性的患者平均生存時(shí)間83.09個(gè)月(95% CI：75.40～90.78個(gè)月)。USP14陽(yáng)性患者生存時(shí)間明顯短于陰性患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.664，P=0.003，圖2)。

圖2 結(jié)直腸癌患者USP14表達(dá)Kaplan-Meier生存分析

為進(jìn)一步分析USP14表達(dá)與患者預(yù)后關(guān)系，采用COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型分析。單變量分析結(jié)果表明USP14表達(dá)(陽(yáng)性vs陰性，HR=2.310，P=0.001)和TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期 vs Ⅰ～Ⅱ期，HR=3.377，P=0.000)與患者不良預(yù)后顯著相關(guān)。多變量分析結(jié)果顯示USP14表達(dá)(HR=2.213，P=0.002)和TNM分期(HR=3.237，P=0.000)可作為結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因子(表2)。

討 論

蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)是調(diào)控多種細(xì)胞功能的關(guān)鍵。細(xì)胞中有兩大系統(tǒng)負(fù)責(zé)調(diào)控蛋白質(zhì)降解，即泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)和溶酶體系統(tǒng)。泛素蛋白酶體系統(tǒng)包含泛素活化酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素結(jié)合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)、泛素連接酶(ubiquitin-protein ligating enzyme，E3)及26S蛋白酶體。泛素連接酶將泛素單體與其靶蛋白的賴氨酸殘基通過(guò)共價(jià)鍵連接，也可通過(guò)將泛素單體逐一連接到前一個(gè)泛素分子的7個(gè)內(nèi)部賴氨酸殘基(K6/K11/K27/K29/K33/K48/K63)上，將單泛素鏈轉(zhuǎn)化為多聚泛素鏈。而去泛素化酶可以從目標(biāo)蛋白上分解這些單肽和多肽鏈[5]。研究表明，去泛素化酶通過(guò)穩(wěn)定關(guān)鍵蛋白，在惡性細(xì)胞的增殖、運(yùn)動(dòng)和耐藥中發(fā)揮重要作用[6]。哺乳動(dòng)物蛋白酶體與3個(gè)重要的去泛素化酶相關(guān)：RPN11、UCH37、USP14[7]。RPN11是19S調(diào)控元件亞基，UCH37和USP14可與19S蛋白酶體可逆結(jié)合[8]。

USP14屬于泛素特異性蛋白酶家族，其編碼基因位于第18號(hào)染色體短臂18p11.32區(qū)，是靠近端粒處的功能基因，對(duì)機(jī)體生命過(guò)程具有重要作用。在真核細(xì)胞中，26S蛋白酶體是蛋白質(zhì)降解的主要位點(diǎn)。哺乳動(dòng)物細(xì)胞26S蛋白酶體中，USP14約占10%～20%。雖然只有一小部分的19S顆粒含有USP14，但細(xì)胞中絕大多數(shù)USP14都與蛋白酶體結(jié)合[9]。USP14參與體內(nèi)蛋白質(zhì)降解的調(diào)控，參與惡性腫瘤進(jìn)展，但其具體作用機(jī)制還未完全闡明。

USP14是哺乳動(dòng)物中高度保守的去泛素化酶，因其在多種腫瘤中的高表達(dá)和重要作用而受到越來(lái)越多的關(guān)注。Tian等[8]研究發(fā)現(xiàn)USP14在多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞中高表達(dá)，b-AP15處理多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞可有效抑制USP14，阻斷細(xì)胞周期進(jìn)程，誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞凋亡。USP14在上皮性卵巢癌組織中USP14表達(dá)水平明顯升高，與腫瘤分級(jí)、腫瘤階段、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與Ki-67表達(dá)呈正相關(guān)，USP14沉默可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。研究發(fā)現(xiàn)USP14在乳腺癌組織中高表達(dá)，其主要分布于乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，與組織學(xué)分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[11]。USP14在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，尤其是在腺癌細(xì)胞中[12]。與鄰近非腫瘤組織比較，食管鱗癌組織在RNA水平和蛋白水平上均出現(xiàn)USP14過(guò)表達(dá)，USP14表達(dá)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)[13]。肝癌組織中USP14表達(dá)水平顯著高于正常肝組織中USP14表達(dá)水平，其過(guò)表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，進(jìn)而促進(jìn)肝癌進(jìn)展[14]。Ishiwata等[15]在結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn)USP14表達(dá)水平高于正常組織。

本研究采用免疫組化分析USP14在結(jié)直腸癌中的表達(dá)情況，研究顯示結(jié)直腸癌腫瘤組織中USP14表達(dá)顯著高于正常組織，USP14表達(dá)與性別、年齡、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期無(wú)顯著相關(guān)，生存分析發(fā)現(xiàn)USP14表達(dá)陽(yáng)性患者預(yù)后較差，可作為結(jié)直腸癌預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。而Shinji等[16]研究表明結(jié)直腸癌患者USP14表達(dá)水平并不高，18.2%(18/99)患者為高表達(dá)，81.8%(81/99)為低表達(dá)，USP14表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、肝轉(zhuǎn)移情況、TNM分期相關(guān)。這可能是由于本研究將結(jié)直腸癌組織USP14表達(dá)情況分為陰性和陽(yáng)性兩組。判斷標(biāo)準(zhǔn)為陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)< 5%為“-”，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥5%為陽(yáng)性。而Shinji等[16]研究中“-”為未檢測(cè)到USP14表達(dá)；“±”為弱于或與正常組織上皮細(xì)胞顯色強(qiáng)度相當(dāng)；“+”為顯色強(qiáng)度強(qiáng)于正常組織上皮細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)將“-”組和“±”組歸為低表達(dá)組，“+”歸為高表達(dá)組。這可能是導(dǎo)致本研究與該文章統(tǒng)計(jì)結(jié)果差異的原因。

以往研究表明，USP14表達(dá)與患者生存率密切相關(guān)，USP14表達(dá)陽(yáng)性患者預(yù)后較差[10～14]。Wang等[10]研究發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌患者中USP14高表達(dá)與生存時(shí)間短顯著相關(guān)，提示USP14可作為卵巢癌患者預(yù)后指標(biāo)。Zhu等[11]研究表明，USP14高表達(dá)的乳腺癌患者生存期明顯縮短，USP14表達(dá)沉默可以抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和遷移，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、USP14表達(dá)、Ki-67表達(dá)是患者整體生存的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)。Wu等[12]研究發(fā)現(xiàn)USP14沉默可抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞周期，并伴隨著β-catenin蛋白質(zhì)水平大幅下降，肺腺癌患者USP14表達(dá)與生存期相關(guān)。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)USP14過(guò)表達(dá)與食管鱗癌患者整體生存率降低有關(guān)，表明USP14是總體生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。Ying等[17]研究發(fā)現(xiàn)USP14高表達(dá)與胃癌患者不良預(yù)后相關(guān)，USP14表達(dá)水平是胃癌患者獨(dú)立預(yù)后因子。此外，USP14沉默促進(jìn)p-ERK和p-Akt蛋白酶體降解，從而阻斷Akt和ERK信號(hào)通路，增加胃癌細(xì)胞對(duì)順鉑敏感度。與上述研究一致，本研究生存分析結(jié)果表明，相比于USP14陰性患者，USP14陽(yáng)性患者的總體生存時(shí)間明顯縮短。進(jìn)一步COX比例風(fēng)險(xiǎn)回歸分析發(fā)現(xiàn)，USP14表達(dá)和TNM分期可作為結(jié)直腸癌患者的獨(dú)立預(yù)后因素。

綜上所述，本研究USP14在結(jié)直腸癌中的表達(dá)和臨床意義，研究表明USP14表達(dá)在結(jié)直腸癌發(fā)展中發(fā)揮重要作用，且USP14表達(dá)與預(yù)后相關(guān)，是結(jié)直腸癌患者獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)，對(duì)結(jié)直腸癌預(yù)后判斷具有重要價(jià)值。