基于微生物發酵的低糖型桑椹精粉制備工藝研究

龍曉珊， 廖森泰， 胡騰根， 鄒宇曉， 李 倩， 黎爾納， 龐道睿， 沈維治

(廣東省農業科學院 蠶業與農產品加工研究所/農業農村部功能食品重點實驗室/廣東省農產品加工重點實驗室， 廣東 廣州 510610)

桑椹又名桑果，為桑科落葉喬木桑樹(MorusalbaLinn.)的果實[1]，富含氨基酸和維生素等營養成分以及脫氧野尻霉素(DNJ)等活性物質[2-4]，具有抗氧化、降血糖等多種營養和保健功能[5]，已被我國衛生部列入“既是食品又是藥品”名錄[6-7]。盡管桑椹富含的DNJ等降血糖功能因子，在中醫臨床和民間食療養生中應用廣泛，但桑椹作為一種天然漿果，其中還含有一定量的葡萄糖和果糖等碳水化合物，如果能通過現代食品加工技術將這些碳水化合物脫除，且盡可能減少DNJ等降血糖功能因子的損失，將有利于改善桑椹的加工性能，拓寬桑椹在食品，尤其是功能食品中的應用領域。乳酸菌和釀酒酵母等微生物可高效脫除桑椹中的碳水化合物[8-10]，同時為發酵產物帶來益生菌，有利于提高桑椹的營養價值和保健功能[11]。針對加工過程桑椹發酵液中益生菌損失較大的問題，可加入黃豆輔料作為保護劑，研究表明，黃豆富含異黃酮、卵磷脂、低聚糖、豆甾醇等功能性物質，可以減少凍干過程中益生菌的損失[11-12]。文章以桑椹為研究對象，考察微生物發酵和凍干處理制備的桑椹精粉在理化特性和加工特性方面的主要變化，為拓展桑椹精粉在食品中的應用積累經驗。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“粵椹大10”新鮮桑椹：成熟度均一(八至九成熟)，無污染、無病蟲害。黃豆，黑龍江北純農產品開發有限公司。

腸膜明串珠菌(Leuconstocmesenteroides)、葡萄酒高活性干酵母(Saccharomycescerevisiae)，廣東省農業科學院蠶業與農產品加工研究所菌種保藏中心。

焦性沒食子酸(分析純)，德州潤昕實驗儀器有限公司；福林酚試劑(分析純)，上海荔達生物科技有限公司。甲醇、乙腈，色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；瓊脂、細菌學蛋白胨、MRS肉湯，廣東環凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

LabSwift- Novasia型水分活度儀，瑞士NOVASINA公司；Agilent 1200 series型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；UitraScan- VIS型自動色差儀，美國HunterLab公司；UV- 1800型紫外分光光度計，日本島津有限公司；WJL- 628型激光粒度分析儀，珠海歐美克儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1樣品的制備

桑椹原粉(mulberry powder, MP)制備：將采摘得到的八九成熟的新鮮桑椹置于60 ℃烘箱中干燥至恒重后取出，粉碎后過40目篩，獲得MP。

發酵液(fermented mulberry，FM)制備：樣品制備方法參照文獻[10]。取一定質量的桑椹原粉，加入4倍的蒸餾水后混勻，高壓滅菌(121 ℃,20 min)。冷卻后，接入腸膜明串珠菌(接種量為3.95×108CFU/mL)，將接種后的桑椹漿置于搖床中(30 ℃，150 r/min)，發酵96 h后，再接入酵母菌(接種量為1.76×105CFU/mL)，放置于搖床中發酵6 h(28 ℃，150 r/min)，即得FM。

桑椹精粉(mulberry extract powder)制備：FM冷凍干燥后得到未添加黃豆輔料的桑椹精粉(freeze-dried fermented mulberry, DFM)。黃豆浸泡3 h后經打漿機打成漿，與發酵液混合均勻并冷凍干燥后得到添加黃豆輔料的桑椹精粉(freeze-dried fermented mulberry mixed with soybean, DFMS)，黃豆和發酵液的質量比為1∶5。

1.3.2單糖含量的測定

參考Zheng等[13]的方法并加以適當的改進。將待測樣品用適量的水溶解，超聲輔助提取30 min，離心10 min(10 000 r/min，4 ℃)，取上清液，用0.22 μm濾膜過濾后用于高效液相色譜分析單糖含量。色譜條件：檢測器為蒸發光檢測器，ELSD漂移管溫度為45 ℃；色譜柱型號為Shodex Asahipak NH2P- 504E(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，柱溫30 ℃；流動相為體積分數75%乙腈，流速為1 mL/min，進樣量為20 μL。以標準品溶液質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算得到樣品的單糖含量。

1.3.3粒徑的測定

參照文獻[14]，采用WJL- 628型激光粒度儀測定樣品的粒徑，測定D90、D50、D10及分散度，重復3次以上。Dn表示有n%的顆粒粒徑小于該數值。

1.3.4水分含量、水分活度、吸濕性的測定

水分含量的測定：采用直接干燥法，稱取1～2 g待測樣品，105 ℃烘干至恒重后稱重計算[15]。

水分活度的測定：使用LabSwift- Novasia型水分活度儀進行測定，重復測定3次以上。

吸濕性的測定：參考蔡延渠等[16]的方法并改進，將飽和NaCl溶液放置在玻璃干燥器中24 h，形成保濕器。稱取1～2 g待測樣品于已干燥至恒重的稱量瓶中，在105 ℃條件下烘干至恒重后稱重，放入保濕器中，7 d后，稱量樣品和稱量瓶的總質量。

1.3.5休止角的測定

在水平實驗臺上放置白紙，漏斗固定在白紙上方，漏斗下端與白紙之間的垂直距離為h；將待測樣品放置在漏斗中，讓其自由散落到白紙上，直至樣品與漏斗下端接觸，并形成圓錐形。測量出圓錐形的半徑r，h與r的比值即為休止角θ的正切值，從而計算出θ[17]。

1.3.6堆密度的測定

將樣品從漏斗中自由散落至10 mL的量筒中，測定樣品的質量和體積，至少重復3次，平行樣品之間的堆密度差值不超過0.01 g/cm3。

1.3.7色澤的測定

采用全自動色差儀測定樣品的色澤[18]。L*表示亮度，值越大，亮度越大；a*表示顏色從綠色(-a*)向紅色(+a*)變化，值越大，代表顏色向紅色度偏移；b*表示顏色從藍色(-b*)向黃色(+b*)變化，值越大，代表色澤向黃色度偏移。ΔE是指總色差，計算見式(1)：

(1)

1.3.8桑椹發酵前后活性成分含量測定

1.3.8.1 DNJ含量的測定

樣品的提取：精確稱取0.5 g樣品，加入0.05 mol/L鹽酸溶液30 mL，充分混勻后超聲30 min，離心后收集上清液，將濾渣用同樣的方法再次提取，重復提取3次，合并上清液。

配制10、20、40、200 μg/mL的DNJ標準溶液[19]，樣品與標準溶液衍生化后待測。

色譜條件：色譜柱型號為ZORBAX SB- C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相為體積分數0.1%醋酸和乙腈(體積比60∶40)，進樣量為20 μL，流速為1 mL/min，等度洗脫25 min；檢測器為DAD型紫外檢測器，檢測波長254 nm，柱溫30 ℃[20]。

1.3.8.2 總多酚含量的測定

配制4、8、12、16、20、24 μg/mL的焦性沒食子酸標準溶液[21]。精確稱取適量樣品，用體積分數60%乙醇溶解，超聲輔助提取27 min，離心后取上清液，重復提取3次。用60%乙醇將上清液定容至50 mL，混合均勻后待測。

含量測定：采用福林酚比色法，取1 mL標準溶液(或樣品提取物)于10 mL試管中，先加入1 mL福林酚試劑，混合均勻后加入2 mL 0.10 g/mL碳酸鈉溶液，混勻，于25 ℃下避光反應60 min后，765 nm測定吸光度。以焦性沒食子酸質量濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標繪制標準曲線，采用外標法測定多酚含量。

1.3.8.3 花青素含量的測定

樣品制備：用酸性乙醇(10 mL體積分數0.1%鹽酸溶液，20 mL體積分數95%乙醇)溶解樣品，50 ℃超聲輔助提取1 h，離心后取上清液重復提取3次。

含量測定：采用pH示差法[22]。14.90 mg/mL氯化鉀溶液和0.2 mol/L 鹽酸溶液以體積比25∶67混合，并用氯化鉀溶液調pH值，得到pH值1.0的緩沖溶液。稱取8.20 g醋酸鈉用蒸餾水定容至500 mL，用0.2 mol/L鹽酸溶液調pH值，得到pH值4.5的緩沖溶液。準確量取5 mL樣品2份，分別用pH值1.0、pH值4.5的緩沖液定容至25 mL，平衡2 h后，分別于510、700 nm處測吸光度。花青素得率計算見式(2)。

(2)

式(2)中，吸光度A=(A510 nm,pH1.0-A700 nm,pH1.0)-(A510 nm,pH4.5-A700 nm,pH4.5);26 900為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的消光系數;1為光程1 cm;449.2為矢車菊花素-3-葡萄糖苷的相對分子質量;DF為稀釋倍數;V為待測花青素樣品儲備液體積，mL;M為待測樣品質量，mg。

1.3.8.4 總黃酮含量的測定

標準溶液的配制及標準曲線的繪制：準確稱取蘆丁標準品10 mg，用體積分數60%乙醇溶解并定容至100 mL，配制成0.1 mg/mL的標準品溶液。準確量取蘆丁標準品溶液0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于10 mL容量瓶中，加入體積分數60%的乙醇溶液至體系的體積為5.0 mL，加入0.3 mL質量分數5%的亞硝酸鈉溶液，混勻后靜置6 min。加入0.3 mL質量分數10%的硝酸鋁溶液，混勻后靜置6 min，再加入4.0 mL質量分數4%的NaOH溶液，最后用體積分數60%的乙醇溶液定容。混勻后在波長510 nm處測吸光度，以標準溶液的質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線。

樣品的提取及測定[23-24]：樣品加入體積分數60%的乙醇，60 ℃利用超聲波輔助提取45 min，離心后取上清液。濾渣用同樣的條件再次提取，重復提取3次，合并上清液。60%無水乙醇定容至50 mL，取0.6 mL反應，反應條件同標準溶液。

1.4 數據處理

實驗數據表示為x±s，采用Word 2010軟件和Origin 8.0軟件繪制圖表。單因素方差分析采用SPSS 19.0軟件。

2 結果與分析

2.1 低糖型桑椹精粉制備過程中果糖和葡萄糖含量分析

MP的果糖和葡萄糖含量分別是10.09、526.41 mg/g，發酵處理之后，果糖和葡萄糖含量降低為0(見圖1)，這是因為微生物在發酵過程中將桑椹的單糖作為能源物質進行充分利用。DFM和DFMS的果糖和葡萄糖含量明顯低于MP，且接近于0，表明低糖型桑椹精粉制備成功。

不同字母表示不同樣品同一指標之間差異顯著(P<0.05)。圖1 低糖型桑椹精粉制備過程中果糖和葡萄糖含量的變化Fig.1 Changes of fructose and glucose content during preparation of low-sugar mulberry extract powder

2.2 低糖型桑椹精粉制備過程中加工特性分析

2.2.1制備過程對桑椹精粉粒徑的影響

圖2顯示了發酵、凍干及添加黃豆輔料處理對桑椹粒徑變化的影響。由圖2可知，MP平均粒徑51.74 μm，有10%的顆粒粒徑小于31.90 μm，90%的顆粒粒徑小于99.74 μm。當桑椹發酵液經凍干處理后，DFM的平均粒徑為19.56 μm，10%的顆粒粒徑小于14.86 μm，90%的顆粒粒徑小于26.34 μm，表明凍干降低了粉末的粒徑。這可能是由于凍干過程中桑椹發酵液內部溶質趨于均勻分布，形成細小的冰晶，在凍干結束后導致其粒徑變小。添加黃豆輔料后，DFMS的平均粒徑最小，為8.42 μm，其中90%的顆粒粒徑小于24.59 μm，10%的顆粒粒徑低于2.53 μm，粉末最細膩。相對于桑椹而言，黃豆在凍干過程中形成的冰晶更小，因此粒徑更小。而且，糖含量可通過影響凍干和粉碎過程中粉體的黏度從而影響粒徑大小。由圖1可知，DFM和DFMS的果糖和葡萄糖含量明顯低于MP，因此低糖型桑椹精粉的黏度顯著小于MP，也是桑椹精粉粒徑明顯小于桑椹原粉的原因(P<0.05)。粒徑的減小，使桑椹粉體的比表面積增大，表面聚合力和吸附力更大，有利于提高粉體的流動性和產品穩定性；同時，有利于增大桑椹活性成分與其提取溶劑的接觸面積，提高活性成分的提取率。

不同字母表示不同樣品同一指標之間差異顯著(P<0.05)。圖2 發酵、凍干及添加輔料對桑椹精粉粒徑的影響Fig.2 Effect of fermentation, freeze-drying and excipient addition on particle size of mulberry extract powder

2.2.2制備過程對桑椹精粉粉體特性的影響

DFM的水分含量和水分活度最低，分別為4.85%、0.27，其次是DFMS，水分含量和水分活度分別為8.61%、0.33；而MP的水分含量和水分活度是最高的，分別為14.44%、0.47，見表1。主要是因為MP是使用熱泵干燥技術烘干的，而DFM和DFMS是利用冷凍干燥技術干燥的，水分會減少得更多。MP的吸濕性比DFM和DFMS都高，三者的吸濕性依次為7.31%、6.59%、6.38%。由此說明發酵后凍干處理能顯著降低桑椹粉的水分含量、水分活度和吸濕性(P<0.05)，提高桑椹粉的貯藏穩定性。

MP的堆密度為0.43 g/cm3，DFMS和DFM的堆密度較小，分別為0.18、0.22 g/cm3，說明發酵后凍干以及添加黃豆輔料都會使桑椹的堆密度明顯變小(P<0.05)，桑椹粉體之間空隙變大，容量變小。可能是由于桑椹發酵凍干后，粉體粒徑減小，造成粉體比表面積增大，表面聚合力增大，從而導致其堆密度變小。DFMS和DFM的休止角沒有顯著性差異(P>0.05)，分別為39.31°和38.88°，都顯著小于MP(45.51°)，說明發酵后凍干處理會使桑椹粉的休止角明顯變小(P<0.05)，粉體流動性變好。由表1可知，與MP相比，DFM和DFMS的吸濕性較低，暴露在空氣中吸收的水分較少；粉體顆粒之間的黏著性越小，其摩擦力小，因此流動性更好。總體而言，桑椹經發酵、凍干及輔料優化后，貯藏穩定性提高，粉體流動性更好。

表1 發酵、凍干及添加輔料對桑椹精粉粉體特性的影響Tab.1 Effect of fermentation, freeze-drying and excipient addition on physical properties of mulberry extract powder

不同字母表示同列數值之間差異顯著(P<0.05)。

2.2.3制備過程對桑椹精粉色澤的影響

以MP作為對照組，對比了發酵、凍干及添加輔料等不同處理后色澤的變化，見表2。MP的L*值、a*值、b*值分別為37.22、5.71、2.82，DFM和DFMS的L*值、a*值、b*值都顯著大于MP(P<0.05)，說明凍干以及添加黃豆輔料都會使桑椹亮度增加，向紅色度和黃色度偏移。這可能與桑椹的粒徑有關，粉體粒徑越小，其混合均勻度和比表面積越大，色澤改善效果更好[15]。由圖2可知，DFM和DFMS的粒徑明顯小于MP，與表2結果一致。以MP作為對照，DFMS、DFM的色差值分別為10.34、20.06。由以上論述可以說明發酵后凍干及添加輔料處理都會明顯改善桑椹的色澤。

表2 發酵、凍干及添加輔料對桑椹精粉色澤的影響Tab.2 Effect of fermentation, freeze-drying and excipient addition on color of mulberry extract powder

不同字母表示同列數值之間差異顯著(P<0.05)。

2.3 低糖型桑椹精粉制備過程中活性物質含量分析

為研究發酵、凍干及添加黃豆輔料等工藝對桑椹DNJ、總多酚、花青素、總黃酮等活性物質含量的影響，對其含量進行了檢測分析，如圖3。MP和FM的DNJ含量分別為0.68、2.07 mg/g，發酵處理能明顯增加桑椹粉DNJ含量，與肖洪等[25]的研究結果一致。而DFM和DFMS的DNJ含量分別為1.39 mg/g和1.03 mg/g，都顯著低于FM(P<0.05)，但明顯高于MP(P<0.05)，說明凍干降低了DNJ的含量。MP、FM、DFM和DFMS的總多酚含量分別為27.70、28.55、25.83、25.85 mg/g，沒有顯著性差異(P>0.05)。說明發酵、凍干以及添加黃豆輔料對桑椹總多酚含量沒有影響。MP的花青素含量為2.86 mg/g，而FM、DFM和DFMS的花青素含量分別為0.50、0.41、0.47 mg/g，三者沒有顯著性差異(P>0.05)，說明發酵會對桑椹花青素造成損失，凍干和添加黃豆輔料不會改變桑椹花青素的含量。有研究表明，微生物發酵桑椹時會產生代謝物，與花青素產生反應，將花青素轉化為其他大分子物質，使花青素含量明顯降低(P<0.05)[26]。MP、FM、DFM、DFMS的總黃酮含量分別為1.24、1.01、1.16、1.30 mg/g，沒有顯著性的差異(P>0.05)，說明發酵、凍干以及添加黃豆輔料對總黃酮的含量沒有影響。研究表明[25]，發酵菌種、接種量、時間、溫度等都會對活性物質含量產生一定的影響，發酵條件的改變會使活性物質含量增加或者減少，也有可能不變。

不同字母表示不同樣品同一指標之間差異顯著(P<0.05)；1-DNJ、總多酚、花青素、總黃酮的計算結果都是將樣品折算為同等質量的桑椹干重得到的。圖3 發酵、凍干及添加輔料對桑椹精粉活性物質含量的影響Fig.3 Effect of fermentation, freeze-drying and excipient addition on active substance contents of mulberry extract powder

3 結 論

經發酵、凍干及輔料優化處理后得到的低糖型桑椹精粉，其加工特性得到改善，部分活性物質含量得到提高。低糖型桑椹精粉水分含量、水分活度、吸濕性明顯小于發酵前，說明發酵凍干后的桑椹粉更耐儲存。與發酵前比，低糖型桑椹精粉堆密度、休止角和粒徑都明顯降低，粉體流動性變好，粉末更加細膩光滑。與未發酵的桑椹粉比較，發酵凍干后，桑椹精粉色澤變亮，向紅色和黃色偏移。發酵提高了桑椹DNJ的含量，但凍干后略微降低；發酵還降低了花青素的含量，但對總多酚、總黃酮含量幾乎沒有影響；凍干以及添加黃豆輔料對總多酚、總黃酮和花青素含量沒有明顯的影響。

桑椹的采摘期集中且儲藏困難，不易保存，將桑椹進行加工處理是必要手段。本實驗證明桑椹經過加工處理后得到的低糖型桑椹精粉具備良好的加工特性，同時部分活性物質含量得到提高，為桑椹的保存和拓寬桑椹在功能食品上的應用，提供了理論依據。