適配體-納米金比色傳感法檢測磺胺二甲氧嘧啶

王衛平， 戴媛媛， 徐 珂， 張 瑩

(浙江師范大學 化學與生命科學學院,浙江 金華 321004)

磺胺二甲氧嘧啶(SDM)是一種用于防治細菌感染的磺胺類藥物，可通過食物鏈的富集作用累積在體內，從而損害人體泌尿和造血系統，產生過敏反應[1]．目前報道的SDM檢測方法有高效液相色譜法[2]、毛細管電泳法[3]、電化學法[4]等，但是這些方法存在操作復雜、設備昂貴、過程耗時、選擇性不高等缺點，限制了其在現場檢測方面的應用．因此，發展新型、簡便、高效的SDM現場快速檢測方法具有重要的意義．

適配體是一類通過指數富集配體的系統進化技術篩選得到的功能核酸，它能與靶標發生特異性的結合，具有易修飾、成本低、穩定性好等優點[5]．近年來，基于納米金(AuNPs)和適配體的新型比色傳感法因其簡便快速、靈敏度高、選擇性好等優點，已廣泛用于金屬離子[6]和小分子[7-9]的檢測．倪璇等[8]基于多菌靈適配體和AuNPs構建了一種新型比色適配體傳感器，用于水體中殺菌劑多菌靈的檢測．該比色傳感法具有較低的檢測限(2.3 nmol/L)和較寬的線性檢測范圍(2.3～800.0 nmol/L)．Ramezani等[9]設計了一種基于三螺旋分子開關和AuNPs的適配體比色傳感器，可用于復雜樣品如牛奶和血清樣品中四環素的檢測，檢測限低至266 pmol/L．

研究以具有良好的光學性質和生物相容性的AuNPs作為比色傳導信號元件，具有高選擇特異性的適配體作為傳感探針，通過優化NaCl濃度、適配體濃度及適配體和AuNPs反應時間，構建了一種快速檢測SDM的可視化比色傳感方法．未加入SDM時，適配體吸附在AuNPs表面，可防止鹽誘導下AuNPs的聚集，溶液為紅色，紫外可見吸收峰在520 nm處．加入SDM后，適配體與SDM發生特異性結合，使得適配體從AuNPs表面脫落，導致AuNPs聚集，溶液顏色由紅色變為藍色，吸收峰紅移至670 nm處．根據AuNPs在670 nm 和520 nm處吸光度比值(A670/A520)的變化，可實現SDM的定量檢測．為了驗證該比色傳感法在實際樣品中的應用性能，將其應用于尿樣中SDM的分析檢測，得到了較高的回收率．

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、土霉素(OTC)、環丙沙星(CIP)、洛美沙星(LOM)購于國藥集團化學試劑有限公司(上海)；氯化鈉(NaCl)購自阿拉丁試劑有限公司(上海)．氯金酸、檸檬酸鈉、SDM適配體(SBA，序列為：5′-C6-GAGGGCAACGAGTGTTTATAGA-3′[10])均購自生工生物工程股份有限公司(上海)．適配體儲備液濃度為4.3 μmol/L．所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水．所有溶液均在4 ℃下避光保存．

紫外可見分光光度計(T9CS型，北京普析通用儀器有限責任公司)；透射電子顯微鏡(JEM-2100F，日本電子株式會社)；電位分析儀(ZS90，馬爾文儀器公司)．

1.2 AuNPs的制備及表征

用于制備AuNPs的玻璃器皿均用新制的王水浸泡處理．AuNPs的制備基于文獻[11]并加以改進，具體如下：向三頸燒瓶中加入50.0 mL氯金酸溶液(0.245 mmol/L)，加熱煮沸后，迅速加入3.0 mL檸檬酸鈉溶液(34.3 mmol/L)．當溶液呈酒紅色后，繼續加熱15 min，自然冷卻至室溫，于4 ℃下儲存．

1.3 SDM的測定

適配體溶液加熱至95 ℃并保持3 min，自然冷卻至室溫．將500 μL AuNPs溶液與300 μL適配體溶液(終濃度為20.0 nmol/L)混合，于25 ℃下振蕩反應5 min．加入100 μL不同濃度的SDM溶液，繼續振蕩反應5 min．加入100 μL 1.0 mol/L NaCl溶液，并用磷酸緩沖液稀釋至1.5 mL，靜置2 min后觀察溶液顏色變化．用紫外可見分光光度計掃描波長為450～700 nm內的吸收光譜，并計算670 nm 和520 nm 處的吸光度比值(A670/A520)．

1.4 樣品處理

樣品為健康人體空腹晨尿．取2.0 mL尿樣于離心管中，4 000 r/min離心5 min，上清液經0.45 μm微孔濾膜過濾．取1.0 mL濾液于10 mL棕色容量瓶，用超純水定容，在4 ℃下避光保存．

2 結果與討論

2.1 比色傳感法檢測SDM的原理

檸檬酸根包覆的AuNPs由于靜電排斥作用可穩定分散于溶液中，在520 nm左右出現最大吸收峰．加入NaCl后，溶液顏色由紅色變為紫色至藍色，這是因為鹽誘導效應引起了AuNPs的聚集；此外，由于表面等離子共振效應的存在，AuNPs的吸收峰紅移至670 nm左右．加入的適配體以范德華力、疏水作用及Au—N或Au—O鍵等形式吸附在AuNPs表面，通過靜電排斥有效阻止AuNPs的鹽誘導聚集，使溶液保持紅色[9]．加入SDM后，適配體與SDM特異性結合形成復雜的剛性結構，該結構能影響AuNPs和適配體堿基之間的作用力，使得適配體從AuNPs表面脫落[12]．在高濃度NaCl條件下，失去適配體保護作用的AuNPs會再次聚集，溶液顏色由紅色轉為紫色至藍色，且520 nm處的吸光度降低(見圖1)．因此，基于AuNPs的聚集程度及相應溶液的顏色變化，可實現SDM的可視化比色檢測；根據AuNPs在670 nm 和520 nm處吸光度比值(A670/A520)的變化，可實現SDM的定量檢測．

圖1 AuNPs在不同溶液中的紫外可見吸收光譜

2.2 不同溶液中AuNPs的表征

利用透射電子顯微鏡對AuNPs在不同溶液中的形貌及聚集狀態進行表征，結果如圖2所示．圖2A表明，分散良好的AuNPs呈光滑的球形，平均粒徑約為15 nm．據文獻[6]報道，粒徑為15 nm的AuNPs溶液在波長為520 nm處的消光系數為2.7×108M-1·cm-1，根據朗伯—比爾定律可得出AuNPs溶液濃度為2.5 nmol/L．加入一定量的NaCl后，AuNPs發生聚集(見圖2B)．而加入適配體后，AuNPs能夠抵抗鹽誘導引起的聚集(見圖2C)．繼續加入SDM，會使吸附的適配體從AuNPs表面脫落，導致AuNPs聚集(見圖2D)．

A：AuNPs；B：AuNPs+NaCl；

為了進一步研究溶液中AuNPs的聚集狀態及其與適配體的作用情況，對不同條件下AuNPs的Zeta電位進行測定．實驗結果表明，AuNPs溶液的Zeta電位為-18.9 mV．AuNPs與適配體混合5 min后，測得Zeta電位為-9.6 mV，表明適配體吸附在AuNPs表面．向上述溶液中再加入SDM，反應5 min后，Zeta電位值為-16.8 mV，表明部分適配體從金納米粒子表面脫落．實驗所得到的Zeta電位變化趨勢與文獻報道結果一致[13]．

2.3 實驗條件優化選擇

2.3.1 NaCl濃度對AuNPs聚集的影響

考察了不同濃度的NaCl溶液對適配體-納米金比色傳感體系吸光度的影響(見圖3)．從圖3A可以看出，未加入NaCl時，AuNPs溶液為紅色且分散良好的溶液，在520 nm處有較大的吸光度；隨著NaCl濃度的增加，體系顏色逐漸從紅色變為淺紫色再變為藍色，520 nm處的吸光度逐漸降低，670 nm處的吸光度逐漸增強．同時，AuNPs溶液在 670 nm 和520 nm 處的吸光度比值(A670/A520)逐漸增加(見圖3B)，這是由于鹽濃度的大小可以改變AuNPs表面所帶的負電荷，鹽濃度越高，AuNPs表面的負電荷越少，則越容易發生聚集[12]．當加入的NaCl濃度高于66.7 mmol/L時，AuNPs表面的負電荷幾乎完全被中和，減小了AuNPs之間的靜電斥力，引起反應體系中AuNPs的聚集．因此，為保證適配體-納米金比色傳感法中AuNPs完全聚集，NaCl的最優濃度為66.7 mmol/L．

A：不同NaCl濃度下AuNPs溶液的紫外可見吸收光譜(從a至i濃度分別為：0，13.3，26.7，40.0，53.3，60.0，66.7，

2.3.2 適配體濃度對AuNPs聚集的影響

適配體濃度的大小會影響AuNPs的聚集程度，進而影響到SDM檢測的靈敏度．因此，實驗考察了不同濃度的適配體溶液(0.2～40.0 nmol/L)對AuNPs的聚集程度和吸光度的影響(見圖4)．如圖4A所示，當適配體濃度為0.2 nmol/L時，AuNPs溶液呈藍色，說明AuNPs主要呈現為聚集狀態，且在520 nm處的吸光度較弱．隨著適配體濃度的增加，AuNPs溶液的顏色逐漸從藍色變為淺紫色再變為紅色，且520 nm處的吸光度逐漸增強．此外，從圖4B可以看出，適配體濃度為0.2～20.0 nmol/L時，AuNPs溶液在670 nm 和520 nm 處的吸光度比值(A670/A520)隨適配體濃度的增加而逐漸降低，當適配體濃度高于20.0 nmol/L時，該比值基本不變，說明此時AuNPs可在溶液中保持良好的分散狀態．因此，為防止鹽誘導下AuNPs的聚集，適配體的最優濃度為20.0 nmol/L．

A：不同適配體濃度下AuNPs溶液的紫外可見吸收光譜(從a至g濃度分別為：0.2，5.0，10.0，16.0，20.0，

2.3.3 適配體與AuNPs反應時間對AuNPs聚集的影響

圖5顯示了AuNPs與適配體分別反應5，10，15，20，25，30 min后，AuNPs溶液在670 nm 和520 nm處的吸光度比值(A670/A520)變化情況．從圖5可以看出，隨著反應時間的延長，該吸光度比值(A670/A520)無明顯改變，說明適配體與AuNPs之間的結合速度較快，適配體與納米金的結合基本達到飽和．因此，為了縮短分析時間，后續實驗中適配體和AuNPs的反應時間設為5 min．

2.4 對適配體-納米金比色傳感法的評估

在最優反應條件(NaCl 66.7 mmol/L，適配體20.0 nmol/L，適配體和AuNPs反應5 min)下，向適配體-AuNPs溶液中加入不同濃度的SDM，并記錄其紫外可見吸收光譜的變化．從圖6可以看出，隨著SDM濃度的增加，溶液顏色由紅色變為紫色至藍色，且AuNPs在670 nm 和520 nm處的吸光度比值(A670/A520)逐漸增大，內插圖為相應的溶液顏色變化．吸光度比值與SDM濃度在0.033～3.333 μmol/L時呈現良好的線性關系(見圖6)，線性方程為y=0.174 8x+0.254 9，相關系數為0.994 3，檢測限為0.003 μmol/L，靈敏度較高，可滿足實際樣品中SDM的檢測需求．

與文獻報道的SDM分析方法相比較(見表1)，本文所建立的方法分析時間縮短至15 min，優于文獻中報道的分析方法．與已報道的高效液相色譜法[2,14]和毛細管電泳法[3]相比，比色傳感法操作簡單、成本低、靈敏度高；而在基于適配體的熒光傳感法[10,15]中，適配體的共價標記過程比較繁瑣、耗時(125 min)，且修飾的熒光基團(和猝滅基團)會降低適配體的親和力和選擇性．因此，本文所建立的適配體比色傳感法無需繁瑣的修飾和標記步驟，具有操作簡單、分析時間短、靈敏度高、裸眼可視等優點．

圖5 適配體與AuNPs的反應時間對吸光度比值的影響

圖6 SDM濃度與吸光度比值的線性關系曲線

方法檢測限/(μmol·L-1)線性范圍/(μmol·L-1)t/min參考文獻基于環糊精有機框架的HPLC法0.0050.032～3.22230[2]毛細管電泳-電化學檢測法0.0580.967～64.44716[3]基于光誘導電子轉移的熒光法0.0320.032～1.61195[10]基于熒光共振能量轉移的熒光法0.0060.032～0.161125[14]基于十二烷基苯磺酸鈉的HPLC法0.0020.003～0.64446[15]適配體-AuNPs比色傳感法0.0030.033～3.33315—

2.5 適配體-納米金比色傳感法對SDM的選擇性

在最優反應條件下，將其他抗生素(如OTC，CIP，LOM等)和金屬離子(如K+，Ca2+，Mg2+，Fe3+等)分別加入到適配體-AuNPs溶液中，記錄其吸光度變化并計算A670/A520值，以考察所建立的適配體比色傳感方法對SDM的選擇性．從圖7可以看出，加入SDM后，AuNPs溶液在670 nm 和520 nm處的吸光度比值約為1.0，而加入抗生素或金屬離子后，該比值均小于0.1．這說明在其他抗生素和金屬離子存在的情況下，所建立的分析方法對SDM有較好的選擇性．

圖7 適配體比色傳感法對SDM的選擇性

2.6 適配體-納米金比色傳感法對尿樣中SDM的檢測

為了評估所建立的適配體-AuNPs比色傳感方法的準確性和適用性，以健康人體尿樣為樣品基質，在最優條件下，分別向適配體-納米金體系中加入3個濃度水平的SDM，并記錄其在670 nm 和520 nm處的吸光度比值變化情況．從表2可以看出，尿樣中SDM的回收率為99.3%～105.1%，相對標準偏差(RSD)小于3.0%．結果表明，所建立的適配體比色傳感法具有良好的準確度和精密度性，可用于尿樣中SDM的快速檢測．

3 總 結

基于鹽誘導下AuNPs的聚集及適配體與目標物SDM之間高選擇特異性結合的原理，建立了一種快速檢測SDM的適配體比色傳感法，并將其成功應用于尿樣中SDM的分析檢測．本文所建立的適配體比色傳感法具有操作簡單、成本低、耗時短、選擇性好和靈敏度高等優點，可用于復雜樣品中SDM的現場快速檢測．此外，該方法還為其他適配體探針定量分析小分子提供了新的思路．

表2 尿樣中SDM的分析結果(n=3)