紅景天對(duì)2型糖尿病大鼠認(rèn)知功能障礙的保護(hù)作用探討

王淑蘭，盧娟娟，張惠琴

（甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730000）

糖尿病的慢性并發(fā)癥之一是認(rèn)知功能障礙，糖尿病認(rèn)知功能障礙極大地危害了人們的身體健康并嚴(yán)重影響著人們的生活質(zhì)量[1]。2型糖尿病（T2DM）為目前對(duì)人類健康最具威脅的疾病之一，葡萄糖是大腦最主要的能量來源，正常情況下，線粒體利用葡萄糖為大腦提供能量，但在高血糖的情況下，線粒體利用葡萄糖產(chǎn)生大量的活性氧自由基，使機(jī)體發(fā)生氧化應(yīng)激增加，腦細(xì)胞功能受損嚴(yán)重，出現(xiàn)認(rèn)知能力下降[2-4]。2型糖尿病的另一基本特征是胰島素抵抗，無論是胰島素抵抗還是胰島素分泌不足都可以影響腦內(nèi)葡萄糖代謝、腦細(xì)胞滲透壓的改變和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)不足，從而改變神經(jīng)生理功能，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[5]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生胰島素抵抗，胰島素信號(hào)通路發(fā)生改變，出現(xiàn)了阿爾茨海默病（AD）特征性的病理變化，β-淀粉樣蛋白（Aβ）沉積和老年斑的形成。Aβ對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的毒性作用是使血管壁淀粉樣變直接導(dǎo)致血管硬化，彈性變差，甚至容易破裂或形成血栓，還誘使神經(jīng)細(xì)胞凋亡，引發(fā)認(rèn)知障礙，因此，防治AD發(fā)病的重要策略之一是抗氧化、抗凋亡。2型糖尿病由于糖利用障礙，引起體內(nèi)大量自由基的形成，導(dǎo)致機(jī)體氧化應(yīng)激反應(yīng)明顯，引起血流動(dòng)力學(xué)改變和微血管病變，并使血管動(dòng)脈硬化明顯，造成血管狹窄，最終引起缺血、缺氧及神經(jīng)損害，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙的形成。

研究表明，胰島素不僅具有調(diào)節(jié)腦內(nèi)新陳代謝、促進(jìn)神經(jīng)元的生長(zhǎng)發(fā)育、調(diào)控腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)釋放的作用，而且在認(rèn)知等高級(jí)智能活動(dòng)中起到了重要的作用。胰島素在大腦內(nèi)的作用已成為海內(nèi)外研究的熱點(diǎn)，關(guān)注胰島素抵抗與AD的關(guān)系可能為AD的早期防治提供有效的新途徑。

探討胰島素抵抗動(dòng)物模型腦組織損傷及紅景天保護(hù)作用的相關(guān)機(jī)制，揭示AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制并選擇有效的防治靴點(diǎn)提供理論依據(jù)，同時(shí)探究天然藥物多效性的特點(diǎn)，從天然藥物寶庫(kù)中發(fā)掘有效預(yù)防和治療記憶減退的藥物提供應(yīng)用價(jià)值。以往研究證明，紅景天具有抗缺氧、抗炎和調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌的作用[4-8]。紅景天的主要單體成分是紅景天苷，紅景天苷能否改善AD所致認(rèn)知和記憶障礙以及其通過哪些機(jī)制發(fā)揮作用的研究報(bào)道很少。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性成年SD大鼠，體重250~350 g，從蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心購(gòu)買，該實(shí)驗(yàn)所有的操作及相關(guān)流程遵守蘭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)委員會(huì)的相關(guān)指導(dǎo)準(zhǔn)則。第一周進(jìn)行喂養(yǎng)以適應(yīng)環(huán)境，采用嚙齒類動(dòng)物飼料的喂食標(biāo)準(zhǔn)，晝夜周期為（8：00—20：00），自由進(jìn)食飲水，室溫（22±2）℃。

1.2 藥物及主要試劑

鏈脲佐菌素（STZ）（美國(guó)Sigma公司）；紅景天干燥粉末（甘肅省中醫(yī)研究所）；血糖儀（三諾生物傳感技術(shù)有限公司）；血糖儀試紙條（三諾生物傳感技術(shù)有限公司）；大鼠解剖手術(shù)臺(tái)（北京合力科創(chuàng)科技發(fā)展有限公司）；胰島素試劑盒ELISA（上海博耀生物科技有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；活性氧（ROS）檢測(cè)試劑盒（上海廣銳生物科技有限公司）；Aβ酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（上海撫生實(shí)業(yè)有限公司）；1%戊巴比妥鈉（湖北鴻運(yùn)隆生物科技有限公司）。

1.3 儀器

水迷宮視頻分析系統(tǒng)（中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所）；低溫離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室開發(fā)有限公司）。

1.4 給藥方法及分組

24只8周健康雄性SD大鼠，體重250～300 g，選取8只作為正常對(duì)照組（隨機(jī)），嚙齒類動(dòng)物飼料喂食，其余用高脂高糖高蛋白飼料喂養(yǎng)8周作為T2DM模型組，腹腔內(nèi)注射鏈脲佐菌素（STZ）27 mg/kg制備T2DM模型，30 min內(nèi)注射完畢，正常對(duì)照組注射生理鹽水。腹腔注射STZ 3天后，眼底靜脈叢取血和制備血清，測(cè)定大鼠空腹血糖（FPG），血清胰島素含量用胰島素ELISA檢測(cè)試劑盒測(cè)定，采血前禁食14 h，其FPG≥11.1 mmol/L，判斷T2DM模型成功與否，造模成功后，各組大鼠按上述方法繼續(xù)飼養(yǎng)4周，根據(jù)文獻(xiàn)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)檢測(cè)大鼠認(rèn)知功能[9]，將存在認(rèn)知功能障礙的T2DM大鼠隨機(jī)分為兩組：AD組、紅景天干預(yù)組，兩組大鼠高糖高脂喂養(yǎng)，同時(shí)分別用等體積生理鹽水和紅景天苷（50 mg/kg/d）灌胃處理21天。正常對(duì)照組等量生理鹽水灌胃。各組大鼠每天上午10點(diǎn)對(duì)其進(jìn)行灌胃，1次/d。

1.5 大鼠的認(rèn)知功能用Morris水迷宮視頻分析系統(tǒng)檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)干預(yù)措施結(jié)束24 h內(nèi)開始Morris水迷宮檢測(cè)[10]。水池直徑為160 cm，高50 cm，平臺(tái)直徑10 cm，高度30 cm。池壁上有N、E、S、W 4個(gè)等距離點(diǎn)，將水池分為4個(gè)象限，平臺(tái)可放在任意一個(gè)象限內(nèi)，平臺(tái)置于水面下1 cm，水溫（25.0±1.0）℃，水中加入漂白劑，使水呈乳白色，在實(shí)驗(yàn)期間迷宮外參照物不變。試驗(yàn)前5天為訓(xùn)練時(shí)間，第6天為測(cè)試。每天上、下午各訓(xùn)練4次（間隔6 h），相鄰兩次訓(xùn)練時(shí)間間隔為1 min。訓(xùn)練時(shí)，入水點(diǎn)隨機(jī)選取，將各組大鼠面向池壁放入池中，記錄各組大鼠尋找到平臺(tái)并爬上平臺(tái)所用時(shí)間，即逃避潛伏期，如果大鼠在2 min內(nèi)未能尋找到平臺(tái)，須將其人為引至平臺(tái)，此時(shí)潛伏期記為2 min。于第5天訓(xùn)練結(jié)束后撤除水下平臺(tái)，于第6天將大鼠面向池壁于同一入水點(diǎn)放入池中，記錄逃避潛伏期和其在2 min內(nèi)跨越平臺(tái)的次數(shù)。

1.6 檢測(cè)大鼠海馬組織中活性氧自由基（ROS）和超氧化物歧化酶（SOD）含量

各組大鼠于水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，用1%戊巴比妥鈉（0.4 mL/kg）進(jìn)行腹腔注射麻醉大鼠，從腹主動(dòng)脈取血，分離血清后置于-20℃冰箱中備檢。每組大鼠取血后，立即斷頭取腦，分離海馬進(jìn)行勻漿，取上清液，一部分置-20℃冰箱中備檢，一部分大腦海馬組織用于測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS和SOD含量。超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒和活性氧自由基（ROS）檢測(cè)試劑盒測(cè)定各組大鼠海馬組織內(nèi)SOD和ROS含量，具體實(shí)驗(yàn)方法見產(chǎn)品說明書。

1.7 血清和腦組織β淀粉樣蛋白（Aβ）含量檢測(cè)

按ELISA試劑盒操作說明測(cè)定血清和海馬組織中Aβ含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 紅景天苷對(duì)AD大鼠認(rèn)知功能的影響

AD組逃避潛伏期明顯長(zhǎng)于正常對(duì)照組（P＜0.05），跨越平臺(tái)的次數(shù)明顯少于正常對(duì)照組（P＜0.05）；紅景天干預(yù)組逃避潛伏期明顯短于AD組（P＜0.05），跨越平臺(tái)的次數(shù)明顯多于AD組（P＜0.05），紅景天苷能夠改善大鼠認(rèn)知能力，見表1。

表1 各組大鼠逃避潛伏期和跨越次數(shù)（±s）

表1 各組大鼠逃避潛伏期和跨越次數(shù)（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與 AD 組比較，#P＜0.05

跨越次數(shù)（次）5.46±0.311.76±0.14*3.17±0.37#組別正常對(duì)照組AD組紅景天干預(yù)組逃避潛伏期（s）14.25±1.5640.96±3.26*25.04±32.58#

2.2 紅景天苷對(duì)AD大鼠海馬組織內(nèi)ROS生成和SOD活性影響

大鼠海馬組織內(nèi)ROS和SOD含量見表2。AD組大鼠海馬組織內(nèi)SOD含量明顯低于正常對(duì)照組（P＜0.05），ROS含量明顯高于正常對(duì)照組（P＜0.05）；紅景天干預(yù)組大鼠海馬組織細(xì)胞內(nèi)SOD含量明顯高于AD組（P＜0.05），ROS含量明顯低于AD組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠海馬SOD和ROS表達(dá)比較（±s）

表2 各組大鼠海馬SOD和ROS表達(dá)比較（±s）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與 AD 組比較，#P＜0.05

ROS 210.14±9.67320.41±11.93*230.83±11.23#組別正常對(duì)照組AD組紅景天干預(yù)組SOD（U/mg）145.27±5.33103.18±4.28*121.33±2.18#

2.3 大鼠血清和海馬組織中Aβ含量比較

與正常對(duì)照組比較，AD組大鼠血清和海馬組織中Aβ含量顯著升高（P＜0.05），紅景天干預(yù)組與AD組比較，血清和海馬組織中Aβ 含量顯著降低（P＜0.05），見表3。

表3 大鼠血清和海馬組織中Aβ含量（±s，μg/L）

表3 大鼠血清和海馬組織中Aβ含量（±s，μg/L）

注：與正常對(duì)照組比較，*P＜0.01；與AD組比較，#P＜0.05

海馬Aβ 0.217±0.0240.672±0.057*0.324±0.064#組別正常對(duì)照組AD組紅景天干預(yù)組血清Aβ 2.632±0.5245.864±0.736*4.347±0.582#

3 討論

3.1 紅景天苷對(duì)T2DM所致AD大鼠模型認(rèn)知功能障礙改善作用的實(shí)驗(yàn)原理

AD認(rèn)知功能受損早期主要表現(xiàn)是記憶減退和學(xué)習(xí)能力的降低，紅景天苷對(duì)T2DM所致AD大鼠模型認(rèn)知功能障礙的改善作用采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)來評(píng)估[9-11]，用本研究方法來評(píng)估T2DM所致AD大鼠學(xué)習(xí)能力和記憶力是一種經(jīng)典的工具。用逃避潛伏期來表示大鼠放入水中到找到隱匿平臺(tái)并爬上平臺(tái)所需時(shí)間。逃避潛伏期愈短，學(xué)習(xí)能力愈強(qiáng)，反映大鼠對(duì)空間認(rèn)知能力的越高，具有認(rèn)知功能障礙的大鼠則表現(xiàn)出逃避潛伏期越長(zhǎng)。此實(shí)驗(yàn)中，由于前期的強(qiáng)化訓(xùn)練，大鼠對(duì)逃生平臺(tái)的具體位置有準(zhǔn)確的記憶，撤去平臺(tái)后，大鼠將反復(fù)通過原隱匿平臺(tái)所在區(qū)域并試圖找到平臺(tái)，這種行為反映了大鼠對(duì)平臺(tái)位置的準(zhǔn)確記憶能力和對(duì)前期經(jīng)驗(yàn)的記憶能力，此稱為記憶保持能力。

在此實(shí)驗(yàn)的測(cè)評(píng)中，給予高糖高脂高蛋白喂養(yǎng)的AD組大鼠游泳軌跡繁亂、盲目，逃避潛伏期較正常對(duì)照組明顯延長(zhǎng)。撤去水下隱匿平臺(tái)后，AD組大鼠在原隱匿平臺(tái)所在象限停留時(shí)間較正常對(duì)照組明顯延長(zhǎng)，跨平臺(tái)次數(shù)明顯減少，表明大鼠空間定向、定位能力及記憶能力出現(xiàn)了顯著損傷，也表明T2DM模型組大鼠出現(xiàn)了認(rèn)知功能障礙。在水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)評(píng)中，紅景天苷干預(yù)治療的AD模型大鼠在學(xué)習(xí)記憶能力方面，表現(xiàn)強(qiáng)于AD組大鼠。在各時(shí)間點(diǎn)紅景天干預(yù)組逃避潛伏期較AD組明顯縮短，在測(cè)試時(shí)間內(nèi)跨平臺(tái)次數(shù)明顯增加。提示紅景天苷干預(yù)治療可較好地改善T2DM所致AD組的學(xué)習(xí)記憶功能。以上數(shù)據(jù)表明，紅景天苷對(duì)AD實(shí)驗(yàn)大鼠模型的認(rèn)知功能障礙具有很好的改善作用。

3.2 紅景天苷對(duì)糖尿病模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及氧化應(yīng)激的影響分析

超氧化物歧化酶（SOD）、活性氧（ROS）是氧化應(yīng)激的標(biāo)志物[12-13]。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，體內(nèi)產(chǎn)生過多活性氧自由基（ROS），氧化程度超出氧化物的清除，從而導(dǎo)致組織損傷[14]。大量生成的ROS不僅直接攻擊細(xì)胞生物膜、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致其壞死，而且ROS還可以作為第二信使，激活核轉(zhuǎn)移，進(jìn)而增加半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族成員的酶活性，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的損傷和凋亡。ROS水平可直接反映細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激的水平。在生理情況下，體內(nèi)氧自由基生成與清除保持一定的平衡。SOD是一種源于生命體的活性物質(zhì)，是機(jī)體抗氧化平衡的重要指標(biāo)[15]，能消除生物體在新陳代謝過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基，而超氧陰離子自由基具有細(xì)胞毒性，可使脂質(zhì)過氧化，損傷細(xì)胞膜，引起炎癥、腫瘤和自身免疫性疾病，并可能促使機(jī)體衰老。因此，生物抗氧化抗凋亡機(jī)制中，SOD的地位愈來愈重要，對(duì)人體不斷地補(bǔ)充SOD具有抗衰老的特殊效果。

此實(shí)驗(yàn)表明，大鼠海馬組織細(xì)胞內(nèi)ROS生成明顯降低，由此提示紅景天苷在一定程度上能夠增加SOD活性而減輕氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞所造成的損傷。

引起學(xué)習(xí)能力和記憶功能衰退又一重要病理因素是海馬組織細(xì)胞凋亡及功能受損。紅景天是一種高效的抗氧化的中藥。紅景天能夠修復(fù)氧化應(yīng)激所造成的細(xì)胞損傷，從而提高大腦學(xué)習(xí)及記憶能力、改善腦細(xì)胞功能，從而改善和治療AD。

3.3 紅景天苷可以降低AD模型大鼠海馬組織中Aβ含量降低

高胰島素血癥時(shí)，胰島素與Aβ競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合胰島素降解酶，使胰島素降解酶活性下降，導(dǎo)致Aβ降解減少，聚集的Aβ可以通過血—腦屏障進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)；反過來，Aβ的沉積又可阻礙胰島素信號(hào)的傳遞[12]。胰島素可調(diào)節(jié)Aβ的水平，胰島素抵抗可通過增加Aβ蛋白表達(dá)而導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙。同時(shí)，Aβ不能正常降解，逐漸沉積形成老年斑，誘導(dǎo)神經(jīng)退行性變甚至凋亡，導(dǎo)致認(rèn)知功能障礙[15-16]。

細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)纖維纏結(jié)和細(xì)胞外β淀粉樣蛋白沉積和大量的神經(jīng)元喪失是AD的主要病理特征。AD發(fā)病的中心環(huán)節(jié)是Aβ在腦組織細(xì)胞內(nèi)的異常代謝和沉積。Aβ介導(dǎo)并參與多種神經(jīng)毒副作用，尤其是氧化應(yīng)激損傷、神經(jīng)元凋亡危害最大。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在一定程度上紅景天苷能夠抑制T2DM的胰島素抵抗大鼠的海馬組織內(nèi)ROS生成，提高SOD活性。紅景天苷減少Aβ在腦組織細(xì)胞內(nèi)的異常代謝和沉積，提高神經(jīng)元清除自由基的能力，從而減輕神經(jīng)元的損傷，改善T2DM認(rèn)知功能損傷[17-19]。