三種精液優化處理技術的多參數對比研究

葉 陳

中山大學附屬第六醫院生殖中心，廣東省廣州市 510610

精液優化處理技術作為輔助生殖(Assisted reproductive technology，ART)中的起始重要環節，其能夠將非精子細胞成分進行有效剔除，并回收有效功能形態精子細胞，以促進精子獲能，為ART后續提供正常形態學精子，提高臨床妊娠率[1-2]。近年來，隨著育齡夫婦不孕不育率的不斷升高，ART技術日臻成熟。目前臨床常見的精液處理方法有上游法(Swim-up)、密度梯度離心法(Density gradient centrifugation，DGC)及DGC衍生法。本研究旨在對不同精液優化方法處理后精子精液常規指標及精子完整性等相關參數變化進行對比，現報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取2018年1月—2019年5月于我院生殖中心就診，且禁欲3～5d后采集并送檢至男科實驗室的100份新鮮精液標本作為研究對象，采集過程中嚴格按照無菌操作流程進行，根據不同處理方式均分為三組。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集：所有參與實驗者禁欲3～5d后，到院取精，收集標本室溫下靜置1h，待精液完全液化后均分為三組，采用上游法、密度梯度離心法及聯合法進行處理，分為SUP組、DGC組及聯合組。

1.2.2 SUP組：取1ml精液液化后以1∶3的比率加入人類輸卵管液體(HTF)，混勻后離心5min(300g)，離心管傾斜45°置于37℃培養箱內上游0.5～1h，靜置避免晃動。培養結束后，吸取導管上層雨霧狀液體，加入2ml HTF液體，混勻，離心5min(1 000r/min)后取上清液，加入0.5ml HTF液，沉淀松散后分層加入HTF液，45°傾斜靜置于培養箱內培養20min，吸取上部精液懸濁液。

1.2.3 DGC組：取2ml濃度80%及2ml 40%的密度梯隊分離液(SAGE，America)，上層加入2ml液化精液，液體分層界面清晰，離心20min(1 800r/min)取上清液，加入2ml擬人輸卵管液(mHTF)及10%血清替代物(SPS)組成的培養液，混勻后離心5min(1 700r/min)，取上清液沉淀團混勻，傾斜45°加入1.5ml洗精劑后，靜置37℃ CO2培養箱內，上游1h。

1.2.4 聯合組：先進行DGC法，再進行SUP法。

1.2.5 檢測方法：精子存活率檢測：取三組處理后樣本10μl，分別滴于載玻片上，用伊紅進行染色，靜置30s后在低倍鏡下選擇分布均勻區域后轉高倍鏡觀察20個視野，計數200個精子，記錄未被染上顏色的精子數量，以此計算精子存活率；活力檢測：用英國HAMILON精子分析儀分別對處理后的三組樣本進行活力檢測；精子形態：取樣(10μl)均勻涂布于載玻片上，室溫下自然干燥，置于95%乙醇固定15min，然后采用傳統巴氏染色法鏡下染色，待涂片自然干燥后，計數200個完整形態精子，記錄其中異常形態精子數，以此計算精子畸形率；DFI(DNA Fracture Index,DNA斷裂指數)與HDS(High DNA Stainbility,高DNA可染性)檢測；通過BD FACSCalibur流式細胞儀對DFI及HDS水平進行測定，檢測試劑盒購自浙江星博生物科技股份有限公司。

1.3 觀察指標 比較三組樣本精子存活率、活力、形態、DFI及HDS水平。精子存活率=活動精子數量/200×100%；精子活力分級：A級(精子活動良好，運動活潑，快速直線運動)、B級(精子活動，運動快速非直線或直線遲鈍運動)、C級(精子活動不良，原地旋轉移動)、D級(精子不能活動)，精子活動率=A級活動率+B級活動率+C級活動率；精子形態：畸形精子包括精子頭部缺陷、頸部及中段缺陷、尾部異常以及過量胞漿殘留，計數過程中凡是異常形態不明顯視為異常精子，未成熟圓形精子、無頭尾精子不予計數，精子畸形率=畸形精子數量/200×100%。精子DFI和HDS值是精子DNA碎片的兩個指標，數值越低表示DNA碎片率低,即精子DNA完整性越好。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0統計學軟件對數據進行統計分析。計數資料以均數±標準差表示，采用方差分析進行差異比較，組間比較采用SNK-q檢驗進行，P<0.05則差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 三組處理后精子基本狀態比較 三組處理后精子存活率、活動率比較差異有統計學意義(P<0.05)，組間比較發現，聯合組精子存活率、活動率均顯著高于其余兩組， SUP組顯著優于DGC組；三組精子畸形率組間差異無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.2 三組處理后精子DFI、HDS水平比較 三組DFI、HDS比較，聯合組DFI、HDS顯著低于其余兩組，SUP組低于DGC組，差異有統計學意義(P<0.05)，見表2。

3 討論

精子優選技術是ART關鍵所在，隨著ART技術的廣泛應用，臨床上更加期望通過優選技術能夠獲得更加有效完整的精子。精液處理過程主要是剔除精液中的精漿、細胞碎片及微生物等非精細胞成分，提高正常形態精子數量密度，提高輔助生殖成功率[3-5]。優選技術中較為成熟的方法以SUP及DGC法為主。SUP法原理主要是依靠精子自身運動，通過在精液上加入密度較低的介質，通過精子自發向上移動實現對精液的處理及分離，報道稱[6-8]，上游法能夠得到高質量、具有完整頂體區域的橢圓形精子，其獲得精子存活率高于其他方法，但精子回收率較低，能夠篩除染色體異常及不成熟精子，但不能提高完整頂體精子比例。DGC法原理則是根據不同活力及密度精子穿透密度梯度界值速度不同，對精子形態能夠進行有效區分，離心后精液各種成分在密度梯度溶液中達到自身平衡，從而根據密度不同分析精子，對抗精子抗體陽性、精漿黏度較大、液化不良的患者具有較高的篩除效率，與SUP法相比，DGC法能夠提高精子的回收率，但精子存活率不如SUP法，因此兩種方法各有利弊，現目前也有部分研究將兩種方法進行合并使用，但對比研究不夠充分[9-10]。目前，精子質量評價指標主要以精子活動率、存活率、形態比較為主，隨著技術發展，精子DFI值正逐漸成為臨床評價精子質量的重要指標，研究證實[11]，含有DNA碎片的精子仍具有使卵子受精的能力，但可能對胚胎發育造成影響，因此DNA完整性是精子優選方法的重要評價指標之一。

表1 三組處理后精子基本狀態比較

表2 三組處理后精子基本狀態比較

研究結果顯示，通過將同質樣本分為三組進行實驗，比較發現，三組在精子狀態比較上，聯合組精子存活率、活動率均顯著高于其余兩組，DFI和HDS值(DNA碎片率的兩個指標)顯著低于其余兩組，SUP組精子存活率、活動率顯著高于DGC組，DNA碎片率顯著低于DGC組；與相關研究結果相似[12]，對于精子濃度較低患者一般首選采用DGC法進行篩選，對精子濃度較高患者可采用聯合法進行，三組精子畸形率進行比較，三種方法對精子畸形率篩選的效率基本相同。對精子DFI及HDS進行比較發現，聯合法精子DFI及HDS值顯著低于其余兩組，而SUP組顯著低于DGC組，這表示聯合組DNA完整性優于其余兩組，而SUP組DNA完整性優于DGC組，這可能與DGC法的離心方式有關，而SUP法與DGC法相比，進行處理后能夠獲得更多DNA完整精子，研究證實，SUP法能夠獲得更多端粒均值較長的精子，而聯合組雖然進行DGC處理后精子DNA碎片率升高，通過離心后進行SUP能夠有效篩選出更加完整DNA的精子，上游后能夠更加徹底去除梯度介質，盡量減少介質對精子的影響，聯合組與單純SUP組相比，能夠在DGC處理時去除精漿、細胞碎片后再進行上游，減少了非精子細胞在上游過程中產生ROS，減少DNA碎片的產生。

綜上所述，與單純上游法或密度梯度離心法相比較，聯合法能夠更好地處理精液中非細胞成分影響，減少對精子功能的影響，對提高精子存活率、DNA完整率具有較好作用。