小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物的制備及功能特性研究

冀世敏，張連富

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫214122）

小麥面筋蛋白（又稱谷朊粉），作為一種小麥加工副產(chǎn)品，是一種蛋白質(zhì)含量高，氨基酸種類(lèi)齊全，且來(lái)源廣泛的植物性蛋白[1-2]。小麥面筋蛋白具有應(yīng)用范圍廣、價(jià)格低廉、經(jīng)濟(jì)性好、自然資源豐富等諸多優(yōu)點(diǎn)，但低的溶解性卻限制了其在食品工業(yè)中的應(yīng)用。因此，提高小麥面筋蛋白的溶解性對(duì)小麥面筋蛋白的進(jìn)一步應(yīng)用具有重大的意義。Kato等[3]通過(guò)在小麥面筋蛋白溶液中加入無(wú)機(jī)鹽酸，研究發(fā)現(xiàn)利用無(wú)機(jī)鹽酸對(duì)小麥面筋蛋白進(jìn)行脫酰胺改性，雖然能提高一些功能特性，但是容易生成有害物質(zhì)，對(duì)小麥面筋蛋白的結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重破壞。Ribotta等[4]研究發(fā)現(xiàn)卡拉膠可與小麥面筋蛋白形成親水復(fù)合物，強(qiáng)化小麥面團(tuán)的筋力，此外海藻酸鈉和果膠能改善面包體積，所有測(cè)試的膠體均降低了面包屑的初始堅(jiān)硬性和咀嚼感。Leon等[5]利用SDS-PAGE和FTIR等手段對(duì)小麥面筋蛋白與卡拉膠的復(fù)合物進(jìn)行分析，研究發(fā)現(xiàn)這種復(fù)合物的功能性質(zhì)發(fā)生變化，且持水性明顯提高。張紅印等[6]采用乙酸酐對(duì)小麥面筋蛋白質(zhì)進(jìn)行酰化改性，其溶解度、乳化能力和起泡能力均得到了提高。

果膠作為一種常見(jiàn)的多糖在食品行業(yè)具有廣泛的應(yīng)用[7]。余映慧等[8]利用高甲氧基果膠所制成的面制品貨架期能大大提高。在果膠的實(shí)際應(yīng)用中，陶民強(qiáng)[9]發(fā)現(xiàn)低酯果膠可以減小面包的比容積；而高酯果膠酯化度與面包比容積正相關(guān)?，F(xiàn)有資料表明，特定多糖能顯著提高蛋白的溶解性，國(guó)內(nèi)外學(xué)者利用果膠和大豆多糖等多糖對(duì)面粉中主要成分小麥面筋蛋白和淀粉的影響已經(jīng)做了一些研究。所以研究一種高溶解度的小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物具有實(shí)際應(yīng)用意義。

本文通過(guò)研究小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物濕熱條件下的最優(yōu)制備工藝，探討評(píng)價(jià)該條件下復(fù)合物的持水性、持油性、起泡性與泡沫穩(wěn)定性，以及乳化性與乳化穩(wěn)定性等功能性質(zhì)，為小麥面筋蛋白的改性研究提供相應(yīng)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

小麥面筋蛋白：河南雪梨花有限公司；果膠：煙臺(tái)安德利果膠股份有限公司；大豆油：益海嘉里食品有限公司；氫氧化鈉、檸檬酸三鈉、鹽酸、檸檬酸等分析純：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇榮華儀器制造有限公司；DELTA320型pH計(jì)：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；真空冷凍干燥機(jī)：德國(guó)CHRIST公司；ME204E型電子天平：梅特勒-托利多儀器上海有限公司；EBA20型離心機(jī)：德國(guó)CHRIST公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 吸取一定量的10 mg/mL牛血清蛋白溶液放置在試管中，分別加蒸餾水至1 mL，然后加4 mL雙縮脲試劑，充分混勻后室溫下放置30 min，然后于540 nm測(cè)定其吸光度。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 樣品溶解度的測(cè)定 配制1%的樣品溶液，室溫靜置30 min，在離心機(jī)上于3 000 r/min下離心30 min，取上清液1 mL于試管中，再添加4 mL雙縮脲試劑，混合均勻，室溫下靜置30 min，測(cè)定540nm波長(zhǎng)處的吸光度，將所得數(shù)值代入1.3.1節(jié)標(biāo)準(zhǔn)曲線中，計(jì)算蛋白濃度。同時(shí)測(cè)定1%的小麥面筋蛋白的溶解度。

1.3.3 小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物的制備 參考孫漣漪等[10]的方法，并做適當(dāng)?shù)男薷?。精確稱取10 g小麥面筋蛋白溶解于100 mL蒸餾水中，稱取一定質(zhì)量的果膠溶解于上述溶液中并調(diào)整其pH，500 r/min條件下反應(yīng)一定時(shí)間后，把懸浮液倒入培養(yǎng)皿中，冷凍干燥。最后將冷凍干燥好的復(fù)合物粉碎，過(guò)100目篩，待用。

1.3.4 小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物最佳制備工藝的確定 以復(fù)合物的溶解度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，分別考察果膠添加量、pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間這4個(gè)因素對(duì)小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物溶解度的影響。

1）果膠添加量的確定。分別配制果膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0%、0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%、3%的反應(yīng)體系，調(diào)整溶液pH至4.5，于45℃，500 r/min條件下攪拌120 min，按照1.3.3節(jié)的方法制備小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物，并測(cè)定所得復(fù)合物的溶解度，篩選最佳果膠添加量。

2）pH的確定。將篩選的最佳果膠添加量，分別配制 pH 為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 的反應(yīng)體系，500 r/min條件下反應(yīng)120 min，按照1.3.3節(jié)的方法制備小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物，并測(cè)定所得復(fù)合物的溶解度，篩選最佳pH。

3）反應(yīng)溫度的確定。以上述最佳果膠添加量和最佳 pH，將反應(yīng)體系分別于 20、30、40、50、60 和 70℃下反應(yīng)，攪拌120 min，按照1.3.3節(jié)的方法制備小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物，并測(cè)定所得復(fù)合物的溶解度，篩選最佳反應(yīng)溫度。

4）反應(yīng)時(shí)間的確定。以上述最佳果膠添加量和最佳pH，將反應(yīng)體系置于最佳反應(yīng)溫度下分別反應(yīng) 15、30、60、90、120、150 和 180 min，按照 1.3.3 節(jié)的方法制備小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物，并測(cè)定所得復(fù)合物的溶解度，篩選最佳反應(yīng)時(shí)間。

1.3.5 小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物制備工藝的優(yōu)化為進(jìn)一步優(yōu)化小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物的制備工藝條件，選取 A：果膠添加量（%）、B：pH、C：溫度（℃）、D：反應(yīng)時(shí)間（min）為實(shí)驗(yàn)因素，進(jìn)行 4 因素 3水平的正交實(shí)驗(yàn)（表1）。

表1 因素水平表Table 1 Table of factors and levels

1.3.6 小麥面筋蛋白-果膠混合物的制備 將果膠粉末和小麥面筋蛋白粉末按小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物最佳質(zhì)量分?jǐn)?shù)在干燥環(huán)境下混勻。以不添加果膠的小麥面筋蛋白為對(duì)照樣品。

1.3.7 持水性的測(cè)定 持水性的測(cè)定參照Z(yǔ)hao等[11]的方法，并做適當(dāng)修改。稱取0.10 g（m1）樣品置于離心管中并稱重（m2）。以1∶20質(zhì)量比的比例加入蒸餾水，攪拌30 min后于3 000 r/min條件下離心10min，倒去上清液后記錄離心管和沉淀物的質(zhì)量（m3）。根據(jù)式（1）計(jì)算小麥面筋蛋白的持水性。

1.3.8 持油性的測(cè)定 持油性的測(cè)定參考Javier等[12]的方法，并進(jìn)行修改。稱取0.50 g（m1）樣品置于離心管中并稱重（m2）。加5 mL大豆油，用玻璃棒攪均，于2 200 r/min條件下離心25 min，倒去上清液后記錄離心管和沉淀物的質(zhì)量（m3）。根據(jù)式（2）計(jì)算小麥面筋蛋白的持油性。

1.3.9 起泡性與泡沫穩(wěn)定性的測(cè)定 配制1%的樣品溶液100 mL，10 000 r/min剪切2 min，然后立刻將溶液倒入量筒中，并記錄泡沫與液體的總體積（V0）。 上述起泡性（FC）的測(cè)定參考 Bernardi等[13-14]的方法，并做適當(dāng)?shù)男薷摹０词剑?）計(jì)算FC。

泡沫穩(wěn)定性（FS）的測(cè)定：將上述剪切后的溶液室溫靜置30 min后，記錄泡沫與液體的總體積（V30），按照式（4）計(jì)算 FS。

1.3.10 乳化性與乳化穩(wěn)定性的測(cè)定 乳化性的測(cè)定：參考趙冬艷等[15-16]的方法，并做適當(dāng)?shù)男薷?。配?.2%的樣品溶液20 mL于離心管中，加入20 mL大豆油，10 000 r/min剪切60 s，于1 500 r/min離心300 s后，靜置，記錄液體總高度（h）和乳化層高度（h1）。按式（5）計(jì)算乳化性。

乳化穩(wěn)定性的測(cè)定：將上述離心管置于85℃水浴鍋中加熱30 min，室溫靜置20 min后，再次在離心機(jī)上用1 500 r/min離心5 min，記錄此時(shí)的離心管中乳化層高度（h2）及總高度（h3）。 按式（6）計(jì)算乳化穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物制備條件的確定

2.1.1 果膠添加量對(duì)小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物溶解度的影響 由圖1可知，隨著果膠添加量的增加，復(fù)合物的溶解度逐步升高，在果膠添加量為1%時(shí)，復(fù)合物溶解度達(dá)到最大，達(dá)到9.80 mg/mL，相比未添加果膠的對(duì)照樣品（溶解度2 mg/mL），溶解度提高了3.7倍。這是由于果膠的加入，使親水集團(tuán)增加，從而使復(fù)合物穩(wěn)定；果膠含量大于1%時(shí)，復(fù)合物的溶解度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但基本保持不變，其原因可能是過(guò)量果膠使復(fù)合物生成反應(yīng)飽和，從而導(dǎo)致其溶解度出現(xiàn)下降。故果膠的最佳添加量為1%。

圖1 果膠添加量對(duì)復(fù)合物溶解度的影響Fig.1 Effect of pectin addition on the solubility of wheat gluten-pectin complexes

2.1.2 pH對(duì)小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物溶解度的影響 從圖2中看出，隨著pH的升高，復(fù)合物與對(duì)照樣品的溶解度均呈先升高后降低趨勢(shì)。在pH為5時(shí)，復(fù)合物溶解度達(dá)到最大，達(dá)到9.81 mg/mL，相比對(duì)照樣品，提高了38.0%。其原因可能是在強(qiáng)酸的環(huán)境下，面筋蛋白的肽鍵斷裂，此時(shí)多糖所帶電荷也較少，不宜發(fā)生靜電相互作用，而pH為5左右時(shí)，多糖所帶的負(fù)電荷明顯增多，小麥面筋蛋白與多糖發(fā)生了靜電相互作用。當(dāng)pH大于5時(shí)，溶解度隨著pH的升高而降低，分析其原因：小麥面筋蛋白的等電點(diǎn)大約為6～8[17-18]，當(dāng)pH在等電點(diǎn)附近時(shí)，蛋白質(zhì)分子帶電量減少，此時(shí)溶解度較小。因此，最佳pH為5.0。

圖2 pH對(duì)復(fù)合物溶解度的影響Fig.2 Effect of pH on the solubility of wheat glutenpectin complexes

2.1.3 溫度對(duì)小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物溶解度的影響 由圖3可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，復(fù)合物的溶解度呈先升高后降低趨勢(shì)，而對(duì)照樣品的溶解度變化趨勢(shì)不顯著。在50℃時(shí)，復(fù)合物溶解度達(dá)到最大，為10.09 mg/mL。分析其原因可能是溫度升高，小麥面筋蛋白分子構(gòu)象輕微改變，立體結(jié)構(gòu)伸展開(kāi)來(lái)，這樣可以使得小麥面筋蛋白和水分之間的相互作用提高，從而使其溶解性升高；但當(dāng)溫度再繼續(xù)升高會(huì)使小麥面筋蛋白的溶解度降低。因此，最佳反應(yīng)溫度為50℃。

2.1.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物溶解度的影響 由圖4可以看出，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，復(fù)合物的溶解度呈先快速升高再緩慢降低的趨勢(shì)，而對(duì)照樣品溶解度變化趨勢(shì)不顯著。在60 min時(shí)，溶解度達(dá)到最高值9.90 mg/mL。分析其原因：隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)會(huì)變得疏松，面筋蛋白分子與果膠分子結(jié)合得更多，復(fù)合物溶解度得到穩(wěn)定；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，產(chǎn)生大量的熱量，使蛋白發(fā)生熱聚集，反而對(duì)復(fù)合物的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的影響，導(dǎo)致其疏水基團(tuán)更加暴露造成溶解度下降。故60 min為最佳反應(yīng)時(shí)間。

圖3 反應(yīng)溫度對(duì)復(fù)合物溶解度的影響Fig.3 Effect of temperature on the solubility of wheat gluten-pectin complexes

圖4 時(shí)間對(duì)復(fù)合物溶解度的影響Fig.4 Effect of reacting time on the solubility of wheat gluten-pectin complexes

2.2 制備工藝的優(yōu)化

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，考察了1.3.4節(jié)中的各個(gè)因素對(duì)溶解度的影響，結(jié)果分別見(jiàn)表2和表3。

由表2正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，影響小麥面筋蛋白溶解度的因素主次關(guān)系為：果膠添加量，pH，溫度，反應(yīng)時(shí)間，其中果膠添加量是最重要指標(biāo)。另外，最佳反應(yīng)組合為A2B2C3D2，即當(dāng)果膠添加量為1%，pH 4.5，溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間60 min時(shí)能最大限度地提高小麥面筋蛋白-多糖復(fù)合物的溶解度。

由表3方差分析結(jié)果可知，果膠添加量、pH和反應(yīng)溫度對(duì)小麥面筋蛋白的溶解度影響顯著，而反應(yīng)時(shí)間影響不顯著。

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal test design and results

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

按上述結(jié)果所得的最佳組合方案A2B2C3D2進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，經(jīng)3次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)，求得平均溶解度為10.44 mg/mL，與正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

2.3 最優(yōu)制備工藝條件對(duì)小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物功能性質(zhì)的影響

2.3.1 溶解度 從圖5可以看出，與對(duì)照組相比，混合物和復(fù)合物的溶解度均顯著提高 （p<0.05），分別為6.10和10.23 mg/mL。相比混合物，復(fù)合物溶解度增加了67.7%，且二者差異顯著。分析其原因：果膠分子中多羥基的親水基團(tuán)使得整個(gè)復(fù)合物的親水性增加，同時(shí)小麥面筋蛋白分子之間的空間位阻增大，從而防止了面筋蛋白分子的聚集，故小麥面筋蛋白溶解度顯著提高。

圖5 溶解度Fig.5 Solubility

2.3.2 持水性與持油性 從圖6可以看出，與對(duì)照組相比，混合物和復(fù)合物的持水性均顯著提高（p<0.05），分別為1.50和2.22。相比混合物，復(fù)合物持水性增加了48.1%，且二者差異顯著。持水性增加是因?yàn)楣z是親水性分子，加入后使得小麥面筋蛋白組織結(jié)構(gòu)變得疏松，其比表面積增大，從而更易與水結(jié)合，顯著增大其持水能力。與對(duì)照組相比，混合物和復(fù)合物持油性有所下降?；旌衔锏某钟托詾?.80，比對(duì)照樣品的1.85下降了2.7%，而復(fù)合物的持油性則下降到1.20，下降了35.1%。持油性下降是因?yàn)閺?fù)合物使小麥面筋蛋白的可溶性蛋白含量增加，二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，疏水性減小，故持油性下降。

圖6 持水性與持油性Fig.6 Water holding capacity and oil-holding capacity

2.3.3 起泡性與泡沫穩(wěn)定性 從圖7中看出，與對(duì)照組相比，混合物和復(fù)合物起泡性有所下降?；旌衔锏钠鹋菪杂稍瓉?lái)的150.1%下降到145.0%，下降了5.1%。而復(fù)合物起泡性出現(xiàn)了進(jìn)一步的下降，其起泡性為138.2%。起泡性下降是因?yàn)榧尤牍z使體系的黏度增加，而泡沫結(jié)構(gòu)中薄層液體的排出速度與體系黏度呈負(fù)相關(guān)，即黏度增加，速度減慢，從而導(dǎo)致起泡性下降。與對(duì)照組相比，混合物和復(fù)合物泡沫穩(wěn)定性均顯著提高（p<0.05）。混合物的泡沫穩(wěn)定性由原來(lái)的60.1%上升到73.1%，增加了13.0%。而復(fù)合物的泡沫穩(wěn)定性進(jìn)一步升高最終到達(dá)88.2%，比對(duì)照樣品的泡沫穩(wěn)定性增加了28.1%，在混合物的基礎(chǔ)上又增加了15.1%。這是因?yàn)楣z的加入使蛋白質(zhì)吸附、展開(kāi)和形成穩(wěn)定的膜，使界面膜加厚，并且增加了泡沫結(jié)構(gòu)中薄層液體的黏度，從而泡沫穩(wěn)定性提高。

圖7 起泡性與泡沫穩(wěn)定性Fig.7 Foaming and foaming stability

2.3.4 乳化性與乳化穩(wěn)定性 從圖8中看出，與對(duì)照組相比，混合物和復(fù)合物乳化性與乳化穩(wěn)定性均顯著提高（p<0.05），混合物的乳化性由8.4%上升到35.8%，是對(duì)照樣品的4.3倍；而復(fù)合物的乳化性達(dá)到了61.3%，是對(duì)照樣品的7.3倍?；旌衔锏娜榛€(wěn)定性由原來(lái)的2.3%上升到15.6%，是對(duì)照樣品的6.8倍，而復(fù)合物的乳化穩(wěn)定性達(dá)到了26.3%，是對(duì)照樣品的11.4倍。分析其原因是果膠的加入提高了蛋白質(zhì)的溶解度，使參與乳化作用的分子大大增加，從而提高了小麥面筋蛋白的乳化性與乳化穩(wěn)定性。

圖8 乳化性與乳化穩(wěn)定性Fig.8 Emulsibility and emulsion stability

3 結(jié)語(yǔ)

通過(guò)在小麥面筋蛋白溶液中加入果膠，從而制備了一種小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物來(lái)提高其溶解度，并且對(duì)制備工藝進(jìn)行了優(yōu)化；另外，還探究了該復(fù)合物的一些功能性質(zhì)，得出如下結(jié)論：

1）本實(shí)驗(yàn)最佳制備工藝：果膠添加量為1%，pH 4.5，溫度50℃，反應(yīng)時(shí)間60 min。在此條下小麥面筋蛋白的溶解度達(dá)到10.44 mg/mL。

2)最佳制備工藝條件下所得小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物與混合物和對(duì)照組相比，乳化性與乳化穩(wěn)定性、泡沫穩(wěn)定性、持水性方面均顯著提高，而起泡性和持油性顯著降低。

3）本實(shí)驗(yàn)制得的小麥面筋蛋白-果膠復(fù)合物能較好地改善小麥面筋蛋白的溶解度，并且制備工藝簡(jiǎn)單，條件溫和，故其有很大市場(chǎng)應(yīng)用性。