環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)在鴨源成分檢測中的研究

吳 瀟 ，呂貝貝 ，蔣 瑋 ，白 藍(lán) ，武國干 ，王金斌 ，，王榮談 ，潘愛虎 ，唐雪明 *

（1.上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院 生物技術(shù)研究所，上海 201106；2.上海市農(nóng)業(yè)遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201106；3.上海瑞豐農(nóng)業(yè)科技有限公司，上海 201106）

食品安全關(guān)系到老百姓的身體健康和生命安全，關(guān)系到社會的穩(wěn)定。肉制品是人們?nèi)粘Ｉ钪兄饕膭游锏鞍讈碓矗ǎ乎r肉（分割肉，肉卷），腌制肉（咸肉，香腸，火腿等），另外還有醬鹵肉，培根，肉干，肉脯，肉丸，調(diào)理肉串等[1-2]。由于肉制品無法具備動物整體形態(tài)的特異性，一旦經(jīng)過加工工藝的處理，消費(fèi)者更是難以辨認(rèn)真假[3]。面對目前牛羊肉市場存在的混亂現(xiàn)象，根據(jù)肉的色澤，氣味，紋理，肥瘦等方面進(jìn)行鑒別的傳統(tǒng)方法已不能滿足職能部門監(jiān)管的需求[4-6]，為了鑒別肉產(chǎn)品的成分，已建立了物理，化學(xué)，免疫學(xué)和分子生物學(xué)等方法[7-9]。

目前，在肉產(chǎn)品的成分檢測中使用的有PCR方法[10-12]，光譜法[13-15]和質(zhì)譜法[16]。 PCR 方法包括常規(guī)PCR 方法、多重 PCR 方法[17]、PCR-RFLP分析方法[18]、熒光定量PCR技術(shù)[19-21]和微滴數(shù)字PCR定量檢測方法[19]。在現(xiàn)有的檢測方法中，無論是PCR方法，還是光譜法和質(zhì)譜法，都是離不開昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器的實(shí)驗(yàn)室檢測方法，側(cè)重于終端產(chǎn)品檢測，難以在現(xiàn)階段我國食品安全事件多發(fā)、樣本分散的情況下及時快速、全面地從源頭和現(xiàn)場進(jìn)行檢測。在肉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管過程中，采集樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測費(fèi)時費(fèi)事，因此非常需要建立一種檢測技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速檢測，并在現(xiàn)場獲得檢測結(jié)果。

等溫擴(kuò)增技術(shù) （Isothermalamplification technology）是PCR技術(shù)的衍生技術(shù)，通過添加不同活性的酶和特異性引物，在恒溫下進(jìn)行反應(yīng)過程，來達(dá)到快速核酸擴(kuò)增的目的，環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是其中的一種[4]。LAMP技術(shù)除了高特異性、高靈敏度外，其優(yōu)勢在于對儀器設(shè)備要求低，置于水浴鍋或恒溫箱中63℃左右保溫30～60 min就能完成反應(yīng)，結(jié)果的檢測不需要進(jìn)行凝膠電泳，只需通過肉眼觀察綠色熒光的生成來判斷，簡便快捷，非常適合現(xiàn)場快速可視化檢測[1]，因此，LAMP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種食源性病毒的基層檢測[22-24]。目前，LAMP技術(shù)應(yīng)用于動物源產(chǎn)品成分的現(xiàn)場可視化速測的研究還鮮有報道。

鑒于商販多用鴨肉對牛、羊肉進(jìn)行摻假，本研究采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)建立了一種鴨源性成分的檢測方法，旨在實(shí)現(xiàn)市面銷售的不同類型肉產(chǎn)品中鴨源成分的現(xiàn)場快速檢測，為市場監(jiān)管部門提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用鴨肉，雞肉，羊肉，牛肉，豬肉均購于上海市超市和農(nóng)貿(mào)市場；冰凍羊肉卷，肉串，牛肉粒，牛肉干等畜肉加工食品購于上海市超市和農(nóng)貿(mào)市場。DNA提取試劑盒、MgSO4、dNTPs、甜菜堿購于生工生物工程（上海）股份有限公司；苯酚、氯仿、異戊醇、乙醇購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Bst DNA聚合酶購于NEB公司。本實(shí)驗(yàn)同時采用酚氯仿抽提法和試劑盒提取樣品的DNA。

1.2 LAMP引物設(shè)計

根據(jù)鴨的基因全序列 （NCBI，accession No.NW_004676510），使用 Primer5.0軟件設(shè)計，經(jīng)BLAST分析篩選出一對品種特異性引物。正向引物：5’-GGGGAATTTAGAGGTCAGT-3’， 反向引物：5’-GAAGCATGGAGGAAGATAG-3’。

對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠回收用于克隆測序，用以驗(yàn)證擴(kuò)增片段為預(yù)期產(chǎn)物。以此序列為模板，登陸Eiken Chemical公司的在線軟件PrimerExplore（http：//www.primerexplorer.jp/e/）設(shè)計引物[15]。設(shè)計一對外引物F3和B3，一對內(nèi)引物FIP和BIP及一對LF和LB引物。內(nèi)引物FIP由F1c、F2（F2c的互補(bǔ)序列）及中間間隔區(qū)組成，BIP由B1c、B2（B2c的互補(bǔ)序列）及中間間隔區(qū)組成（表1）。

表1 LAMP引物的設(shè)計Table 1 Primers designed of LAMP

1.3 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.3.1 引物對LAMP反應(yīng)的影響 內(nèi)引物和外引物的濃度比例優(yōu)化：依次按照內(nèi)、外引物比例1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，選擇最佳濃度比。

1.3.2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 為了確定LAMP反應(yīng)的最佳溫度，用梯度PCR儀設(shè)計溫度梯度為58.0～65.0℃內(nèi)的12個梯度，其他反應(yīng)條件不變，確定LAMP反應(yīng)的最適溫度。

1.3.3 MgSO4添加量的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)對MgSO4添加量進(jìn)行了優(yōu)化，將反應(yīng)體系中的MgSO4添加量依次設(shè)為 0、0.5、1.0、1.5 和 2.0 μL，分別進(jìn)行 LAMP 反應(yīng)，確定MgSO4的最佳反應(yīng)添加量。

1.3.4 甜菜堿添加量的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)對甜菜堿添加量進(jìn)行了優(yōu)化，將反應(yīng)體系中甜菜堿添加量依次設(shè)為 0、1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0 μL， 分別進(jìn)行 LAMP反應(yīng)，確定甜菜堿的最佳反應(yīng)添加量。

1.3.5 Bst DNA聚合酶添加量的優(yōu)化 Bst DNA聚合酶的濃度為8 U/μL，本實(shí)驗(yàn)對Bst DNA聚合酶添加量進(jìn)行了優(yōu)化，將反應(yīng)體系中的Bst DNA聚合酶添加量依次設(shè)為 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 和 1.2 μL，根據(jù)擴(kuò)增結(jié)果確定Bst DNA聚合酶的最佳添加量。

1.3.6 反應(yīng)時間的優(yōu)化 將LAMP反應(yīng)時間分別設(shè)定為 25、30、35、40、45、50、55 和 60 min， 根據(jù)產(chǎn)物亮度確定LAMP反應(yīng)完成的最短時間。

1.3.7 dNTPs添加量的優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)對dNTPs添加量進(jìn)行了優(yōu)化，將反應(yīng)體系中的dNTPs添加量依次設(shè)定為 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 和 4.5μL，分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)，確定dNTPs的最佳反應(yīng)添加量。

1.4 LAMP引物特異性和靈敏度分析

使用設(shè)計的鴨的LAMP引物分別在羊肉，牛肉，豬肉，雞肉和不同品種的鴨肉中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)。為了判斷引物能否用于混合肉（市場上出售的含有鴨肉成分的牛羊肉）中鴨源成分的檢測，按照一定的比例將牛羊肉的DNA和鴨肉DNA混合在一起使混合DNA中鴨DNA的含量分別是100%、50%、10%、5%、1%、0.5%和0.1%。

1.5 市場牛羊肉制品抽樣調(diào)查

對市場上買回來的羊肉卷，牛肉卷和牛肉粒采用DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取：首先將離心管做好編號；將動物組織放入研缽，加入液氮并快速磨碎，稱取磨好的組織30 mg放入已編好記號的離心管中；然后按照DNA提取試劑盒的操作說明依次進(jìn)行，最后把提取的DNA冷藏備用。然后由兩個實(shí)驗(yàn)室同時分別使用PCR特異引物（SNT3731.5—2013）和LAMP引物（表1）對每個樣品的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，記錄LAMP檢測的結(jié)果和常規(guī)PCR的結(jié)果，并進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 LAMP反應(yīng)的檢驗(yàn)與驗(yàn)證

為了保證LAMP擴(kuò)增的為目的片段，對LAMP產(chǎn)物進(jìn)行驗(yàn)證。使用引物F3和B3對LAMP的產(chǎn)物進(jìn)行重擴(kuò)增，得到一條250 bp長度左右的亮帶，然后割膠回收片段進(jìn)行克隆測序，得到序列長度是241 bp，如圖1所示。將測序得到DNA片段進(jìn)行比對分析，確認(rèn)LAMP反應(yīng)擴(kuò)增的是目的片段，沒有發(fā)生非特異性擴(kuò)增。

圖1 重擴(kuò)增獲得的序列Fig.1 Sequence re-amplification

2.2 LAMP引物特異性

選擇鴨肉和牛肉、豬肉、雞肉、羊肉的DNA作為LAMP反應(yīng)的模板，按照優(yōu)化好的LAMP反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng)并檢測結(jié)果，如圖2所示。

圖2 LAMP反應(yīng)的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.2 Result of specificity test of LAMP reaction

由圖2可知，只有鴨肉的DNA能擴(kuò)增出特異性條帶，而在其他4個物種中的擴(kuò)增結(jié)果為陰性，說明本研究建立的LAMP方法具有特異性。

2.3 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.3.1 引物對LAMP反應(yīng)的影響 為了研究不同內(nèi)外引物濃度比例對LAMP反應(yīng)的影響，固定內(nèi)引物的濃度改變外引物的濃度，結(jié)果如圖3（a）所示。在反應(yīng)體系中，當(dāng)內(nèi)引物與外引物的濃度比例為1∶1～1∶8時均可產(chǎn)生梯形條帶，內(nèi)引物與外引物的濃度比為1∶4和1∶5時條帶最亮，為節(jié)約引物成本，故選擇內(nèi)引物和外引物濃度比為1∶4的反應(yīng)體系。

2.3.2 反應(yīng)溫度的優(yōu)化 根據(jù)梯度PCR儀設(shè)計溫度 58.0～65.0 ℃12 個梯度分別為 58.0、58.4、58.8、59.5、60.4、61.3、61.9、62.8、63.5、64.4、64.8 和 65.0 ℃，進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖 3（b）所示。 由圖 3（b）可見，1～12泳道均有梯形條帶，說明58.0～65.0℃溫度下都能進(jìn)行反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)溫度為63.5℃時LAMP反應(yīng)的條帶最亮，因此確定LAMP反應(yīng)的最適溫度為63.5℃。

2.3.3 MgSO4添加量的優(yōu)化 將反應(yīng)體系中的MgSO4添加量依次設(shè)為 0、0.5、1.0、1.5 和 2.0 μL，分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖3（c）所示。由圖3（c）可見，當(dāng)LAMP反應(yīng)體系中MgSO4添加量從0.5 μL開始出現(xiàn)梯形條帶，MgSO4添加量為 1.0 μL時LAMP反應(yīng)的條帶最亮，因此確定LAMP反應(yīng)的MgSO4最佳反應(yīng)添加量為5 mM/μL。

2.3.4 甜菜堿添加量的優(yōu)化 將反應(yīng)體系中甜菜堿添加量依次設(shè)為 0、1.0、2.0、3.0、4.0 和 5.0 μL，分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖3（d）所示。由圖3（d）可見，當(dāng)LAMP反應(yīng)體系中不添加甜菜堿時，也能擴(kuò)增出梯形條帶。但隨著甜菜堿添加量的增加，條帶不斷增亮。當(dāng)甜菜堿添加量為5.0 μL時，條帶最亮，因此確定甜菜堿的最佳反應(yīng)添加量為0.25μmol/μL。

2.3.5 Bst DNA聚合酶添加量的優(yōu)化 改變反應(yīng)體系中的Bst DNA聚合酶添加量分別進(jìn)行LAMP反應(yīng)，結(jié)果如圖 3（e）所示。 由圖 3（e）可見，當(dāng) LAMP反應(yīng)體系中Bst DNA聚合酶添加量從0.2 μL開始出現(xiàn)梯形條帶，當(dāng)Bst DNA聚合酶添加量達(dá)到1.0μL時，梯形條帶最亮。因此確定LAMP反應(yīng)的Bst DNA聚合酶的最佳反應(yīng)添加量為0.4 U/μL。

2.3.6 反應(yīng)時間的優(yōu)化 反應(yīng)時間是LAMP擴(kuò)增效率的一個重要因素，按照反應(yīng)的時間梯度進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖 3（f）所示。 由圖 3（f）可見，第二泳道開始出現(xiàn)條帶，LAMP反應(yīng)的最短完成時間為30min。隨著反應(yīng)時間的增加，產(chǎn)物的亮度稍有增加，30 min即可滿足檢測的要求。

2.3.7 dNTPs添加量的優(yōu)化 將反應(yīng)體系中的dNTPs添加量依次設(shè)為 0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 和 4.5 μL，分別進(jìn)行 LAMP 反應(yīng)，結(jié)果如圖3（g）所示。 由圖 3（g）可見，當(dāng) LAMP 反應(yīng)體系中dNTPs添加量從0.5 μL開始出現(xiàn)梯形條帶，dNTPs添加量為3.5 μL時條帶最亮，因此確定LAMP反應(yīng)的dNTPs最佳反應(yīng)添加量為1.75 mM/μL。

2.4 LAMP反應(yīng)靈敏度實(shí)驗(yàn)

用提取的牛肉、羊肉DNA溶液對鴨肉DNA進(jìn)行梯度稀釋，將混合DNA作為擴(kuò)增模板，按照優(yōu)化好的LAMP反應(yīng)體系和條件進(jìn)行LAMP反應(yīng)。以牛肉為例，結(jié)果如圖4所示。

圖3 LAMP擴(kuò)增條件優(yōu)化Fig.3 Conditions optimized for LAMP amplification

圖4 LAMP反應(yīng)靈敏度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Result of sensitivity test of LAMP reaction

以牛肉為例，由圖4可見，當(dāng)鴨肉DNA含量為100%～0.1%，電泳出現(xiàn)梯狀條帶，擴(kuò)增產(chǎn)物加入SYBR Green I染料后變綠色。用核酸測定儀測得鴨肉DNA質(zhì)量濃度為 130 μg/μL，鴨源 DNA為0.1%時，鴨源DNA質(zhì)量濃度為13 pg/μL。說明該方法對鴨肉DNA的檢測靈敏度可達(dá)到10 pg/μL左右，而且高濃度牛肉或羊肉DNA的存在對鴨肉DNA的檢測靈敏度沒有影響。

2.5 市場牛羊肉制品抽樣調(diào)查

從上海閔行區(qū)3個超市和2個農(nóng)貿(mào)市場采集了21份樣品（圖5），包括五香鹵牛肉，鹽水牛肉，肥牛，羊肉卷，羊肉串，牛肉醬和牛肉粒等。利用建立的LAMP檢測方法對市售牛羊肉食品進(jìn)行抽樣檢測，采用常規(guī)PCR技術(shù)進(jìn)行驗(yàn)證（表2）。

圖5 21份樣品的LAMP檢測結(jié)果Fig.5 Results of 21 samples by LAMP

表2 21份待測樣品的檢測結(jié)果Table 2 Text results of the 21 samples

由表2可見，牛肉的加工產(chǎn)品和羊肉卷檢測出摻入了鴨源成分，在3種牛肉粒中檢測不到牛肉成分，其中3號牛肉粒既無牛源成分也無鴨源成分；有5份樣品中存在鴨源成分，分別是牛肉粒（S 5，S 10），牛肉干（S 6），牛肉醬（S 15）和羔羊肉卷（S 16）。

3 討 論

自2000年Notomi在Nucleic Acids Res雜志上公開了LAMP技術(shù)后，立即受到了各國學(xué)者、世界衛(wèi)生組織和相關(guān)政府部門的關(guān)注。日本榮研公司完成了H1N1環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增法檢測試劑盒的研制，并通過早期快速診斷防止該病癥的快速蔓延。短短幾年，LAMP技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種食源性病毒[22，25]、細(xì)菌、寄生蟲等引起的疾病檢測、食品化妝品安全檢查及進(jìn)出口快速診斷中[1，5]。如鴨瘟病毒（DPV）檢測方法[26]、鴨 I型肝炎病毒（DHV I）LAMP可視化檢測方法[23]、鴨圓環(huán)病毒（DuCV）的LAMP快速檢測方法[24]，此外還用于轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測[25]。

LAMP方法和常規(guī)PCR方法相比，LAMP反應(yīng)在恒溫下進(jìn)行，省去了升溫和降溫的步驟，縮短了檢測時間；LAMP方法只要有恒溫加熱裝置即可完成擴(kuò)增過程；常規(guī)核酸擴(kuò)增產(chǎn)物需要用凝膠電泳來檢測，而LAMP方法可以直接用肉眼觀察，可以在現(xiàn)場完成高靈敏度的快速可視化檢測，這是其他檢測方法無法實(shí)現(xiàn)的。在肉產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)管過程中，采集樣品帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測費(fèi)時費(fèi)事，如出現(xiàn)樣品混淆，則導(dǎo)致無法得到準(zhǔn)確的檢測結(jié)果，因此LAMP方法更符合基層及市場快速檢測的需要。

在LAMP反應(yīng)體系中，多個因素會影響LAMP的檢測效果。本研究對內(nèi)外引物濃度比例、反應(yīng)溫度和時間、MgSO4、dNTPs、Bst DNA 聚合酶、 甜菜堿的添加量進(jìn)行了優(yōu)化。在優(yōu)化后的LAMP檢測體系中，鴨肉DNA的檢測靈敏度可達(dá)到10 pg/μL。在混合肉的檢測中，LAMP方法的檢出限高于PCR和液相色譜、質(zhì)譜聯(lián)用[16]。在單一鴨源成分的檢測中，LAMP方法的靈敏度高于PCR方法，比傳統(tǒng)的PCR方法高4個數(shù)量級，雖低于熒光定量PCR技術(shù)的檢出限1.78 pg[27-28]，但是已經(jīng)完全滿足實(shí)際意義上的檢測需求。李向麗等[29]建立的LAMP法快速檢測羊肉及其制品中的豬，鴨成分，反應(yīng)時間需要60 min，靈敏度為0.5%。本研究建立的反應(yīng)體系在金屬模塊浴中63.5℃30 min即可肉眼觀察結(jié)果，并且靈敏度達(dá)0.1%。與李向麗等建立的LAMP體系相比，除了引物不同之外，本研究優(yōu)化的LAMP擴(kuò)增體系中內(nèi)引物濃度、dNTPs添加量和Bst DNA聚合酶添加量都較高，這可能是反應(yīng)時間能縮短的原因之一。

有研究者報道LAMP方法容易出現(xiàn)假陽性，為了驗(yàn)證本研究建立的鴨源成分LAMP快速檢測方法的準(zhǔn)確性，運(yùn)用該方法對市售牛羊肉食品進(jìn)行抽樣檢測。同時，根據(jù)SNT1119—2002標(biāo)準(zhǔn)，對樣品進(jìn)行了牛、羊成分的檢測，檢測結(jié)果顯示兩種方法的鑒定結(jié)果一致。其中3號牛肉粒LAMP方法的檢測結(jié)果是既無牛源成分也無鴨源成分，常規(guī)PCR也顯示該牛肉粒樣品中沒有牛、羊、豬、鴨源成分存在，該樣品可能含有別的動物成分。在本研究中，建立的LAMP方法未出現(xiàn)假陽性，可能跟樣本含量小有關(guān)系，今后需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本含量對本研究建立的方法進(jìn)行驗(yàn)證。

4 結(jié) 語

本研究建立的LAMP檢測體系可以用于不同類型肉產(chǎn)品中鴨源成分的現(xiàn)場快速檢測。對單一鴨肉DNA的檢測限達(dá)到10 pg/μL，對牛羊肉中混入鴨源成分比例的的檢測靈敏度為0.1%。