秋刀魚中組胺菌的分離及其理化性質研究

江 凱，王韋華，陳 偉，王利斌，湯海清，羅海波，郁志芳

（1.浙江醫藥高等專科學校 食品學院，浙江 寧波 315100；2.南京農業大學 食品科技學院，江蘇 南京 210095；3.浙江萬里學院 生物與環境學院 浙江省水產品加工技術研究聯合重點實驗，浙江 寧波315100；4.南京師范大學食品與制藥工程學院，江蘇 南京 210043）

秋刀魚（Cololabis saira），俗稱竹刀魚，廣泛分布于西北太平洋公海及其沿岸海域，是一種重要的遠洋經濟魚類[1]。秋刀魚含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸、礦物質和維生素等，味道鮮美，營養豐富，而且具有一定的抑制高血壓、心肌梗塞和動脈硬化等作用，深受廣大消費者喜愛[2]。然而，秋刀魚從捕撈到直接銷售或加工至少需要2個月，在貯藏銷售過程中經常會因微生物的活動產生大量生物胺尤其是組胺，而人體攝入8～40 mg組胺即可引起輕微中毒，嚴重的可致休克甚至死亡[3-4]。研究表明，青皮紅肉魚類（如鯖魚、鮐魚、金槍魚、秋刀魚、沙丁魚、鰹魚等）中組胺產生與組胺菌生長代謝直接相關，水產品在沒有受到組胺菌污染的情況下即使腐敗也不會產生組胺，抑制組胺菌的生長代謝有利于降低青皮紅肉魚類的組胺含量，因此對水產品中組胺菌的分離鑒定及其理化性質的研究成為科研人員的重要課題。目前，研究人員已從鰹魚[5-6]、金槍魚[7]、鲅魚[8]、鯖魚[9]和發酵魚[10]等水產品中分離出了幾十種組胺菌，但不同的產品及不同的貯藏條件其優勢組胺菌有較大差異。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 秋刀魚原料購自寧波南聯冷凍食品有限公司，取7條凍藏（-18℃）保存的秋刀魚用無菌袋裝好，于4℃放置5 d備用。

1.1.2 試劑 磷酸組胺、三氯乙酸、硫代巴比妥酸、正戊醇、對硝基苯胺、亞硝酸鈉、鹽酸二甲基對苯二胺、α-萘酚、無水乙醇、高氯酸、氫氧化鈉、鹽酸、硼酸、酚酞、甲基紅、次甲基藍等均為分析純；蛋白胨、酵母浸膏、瓊脂、平板計數瓊脂（PCA）、胰蛋白胨大豆瓊脂（TSA），杭州百思生物技術有限公司；結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）、硫代硫酸鈉檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）、假單胞菌瓊脂基礎（CN基礎），杭州微生物試劑有限公司；假單胞菌CFC選擇培養基、大腸桿菌生化鑒定管（HBIG13）、腸桿菌科細菌生化鑒定條（HBIG08）及相關試劑盒，青島海博生物技術有限公司。

1.1.3 儀器 THZ-98A恒溫調速多用振蕩器，金壇市維誠實驗器材廠；G6全自動菌落計數器，SHINESO迅數；SW-CJ-1F潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；智能恒溫恒濕箱，寧波海曙賽福實驗儀器廠；HH-4數顯恒溫水浴鍋，上海維誠儀器有限公司；BSA224S-CW電子天平，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；UV2200型紫外可見分光光度計，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；自動旋渦混合器，天津藥典標準儀器廠；DHG-9247A電熱恒溫干燥箱，上海賀德實驗設備有限公司；SCIENTZ-09無菌均質器，寧波新芝生物科技股份有限公司；MLS-3780高壓蒸汽滅菌器，三洋電機株式會社；AllegraTM64R臺式高速冷凍離心機，德國貝克曼公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制 組胺選擇性培養基：酵母膏5 g、胰蛋白胨 5 g、L-組氨酸 20 g、氯化鈉 5 g、瓊脂 15 g、甲酚紅（0.5 g/100 mL）20 mL，蒸餾水定容至1 000mL，調pH值至6.5。組氨酸肉湯液體培養基：酵母膏3 g、蛋白胨10 g、L-組氨酸5 g、葡萄糖10 g，50%海水定容至1 000 mL，調pH值至6.5。半海水培養基：酵母膏 2.5 g、牛肉膏2.5 g、蛋白胨5 g、葡萄糖1 g、瓊脂20 g，50%海水定容至 1 000 mL，調pH值至7.0。半海水流動培養基將瓊脂改為3 g，其余不變。以上培養基121℃蒸汽滅菌15～20 min，冷卻備用[3，9]。

1.2.2 菌株分離純化 無菌操作下稱取25 g秋刀魚中段（含內臟）樣品絞碎后放入無菌袋，加入225mL 0.9%無菌生理鹽水，于均質器中拍打3 min，按照 10 倍稀釋法稀釋為 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6備用。分別吸取不同稀釋度菌液0.1 mL于平板計數瓊脂（PCA）培養基、半海水培養基、假單胞菌CFC選擇性培養基、結晶紫中性紅膽鹽葡萄糖瓊脂（VRBGA）培養基、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖（TCBS）瓊脂培養基和假單胞菌瓊脂（CN）基礎培養基，置36±1℃培養48～72 h。根據菌落邊緣、顏色、大小、凹凸等特性，挑取不同菌落接種于胰胨大豆瓊脂（TSA）斜面，36±1℃培養48 h。將TSA斜面菌種接種于組胺選擇性培養基，36±1℃培養48 h，周圍顯紅色的菌落為組胺菌。

1.2.3 組胺定性檢測 參照陶志華等[3]的方法稍作修改。將單菌落接種于組氨酸肉湯液體培養基，36±1℃培養24～48 h，取1 mL培養液加入5 mL 80%乙醇，12 000 r/min離心10 min，將上清液轉移到新的試管中，加入0.5～1 mL 0.5%甲酚紅溶液，振蕩后與空白對照（黃褐色）進行比較，陽性組呈橙紅色。

1.2.4 組胺定量檢測 參照GB/T 5009.45—2003水產品衛生標準的分析方法測定樣品中組胺含量[10]。

1.2.5 理化性質分析 1）革蘭氏染色：參照文獻[11]所述革蘭氏染色法操作。

2）運動性檢測：用接種針取少量菌種接種于半流動海水培養基實驗管內，36±1℃培養48 h后觀察。實驗管內培養基全部呈渾濁狀態為具有運動性，只在接種處生長的菌種為非運動性[12-13]。

3）HBIG13和HBIG08實驗：挑取單菌落于無菌生理鹽水中振蕩均勻，每孔加入100 μL菌懸液，其中固體和半固體生化管采用穿刺接種，按照鑒定管/條說明書進行操作。賴氨酸、鳥氨酸和氨基酸對照用滅菌的石蠟覆蓋液面。接種后蓋上蓋子，36±1℃培養48 h，根據顏色變化判定陽性和陰性[12-13]。

4）氧化酶實驗：取白色潔凈濾紙沾取菌落，加鹽酸二甲基對苯二胺溶液一滴，陽性者呈現粉紅色，并逐漸加深；再加α-萘酚溶液一滴，陽性30 s內呈現鮮藍色，陰性2 min內不變色[12-13]。

5）過氧化氫酶實驗：用接種環取培養48 h的斜面菌種一小環涂抹于無菌載玻片上，滴1滴3%H2O2溶液，如有氣泡產生則為陽性，無氣泡產生則為陰性[12-13]。

6）糖分解實驗：在組氨酸肉湯培養液實驗管內放入發酵管，121℃蒸汽滅菌20 min，冷卻至40℃左右，用接種針取少量菌種接種于實驗管內，36±1℃培養48 h后觀察。發酵管內有氣體為陽性，否則為陰性[12-13]。

1.2.6 不同溫度對分離菌株組胺產生能力的影響吸取分離純化后的菌株培養液20 μL接種到5 mL組胺酸肉湯培養液中（pH 值 6.5），分別于 4±1、20±1、25±1、30±1 和 36±1 ℃靜置培養 24 h， 吸取 0.5mL均一的組胺酸肉湯培養液，加入1.5 mL 80%乙醇，8 000～10 000 r/min離心10 min，上清液按照GB/T 5009.45所述方法測定組胺濃度。

1.2.7 不同pH值對分離菌株組胺產生能力的影響吸取分離純化后的菌株培養液20 μL分別接種到5mL 不同 pH（4.5、5.5、6.5、7.5、8.5）的組胺酸肉湯培養液中，于36±1℃靜置培養72 h，每24 h取樣測定組胺濃度。

1.3 數據處理

實驗每個處理均重復3次，分別求其平均值和標準差，并用統計軟件SPSS19.0進行顯著性（LSD；p＜0.05）分析，用 Excel軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 微生物分離

預實驗研究結果表明，新鮮秋刀魚菌落總數在（1.6～2.2）×102cfu/g之間，組胺菌數量較少，采用100、10-1、10-2稀釋度菌懸液均未分離獲得組胺菌，而秋刀魚在0～4℃低溫下貯藏期間菌落總數迅速上升，貯藏5 d已超過1.0×106cfu/g。因此，為獲得較好的分離效果，實驗將秋刀魚于4℃放置5 d后進行組胺菌分離。秋刀魚菌懸液通過PCA培養基、半海水培養基、CFC選擇性培養基、VRBGA培養基和TCBS瓊脂培養基初篩，獲得菌落特征不同的菌株10株，挑取單菌落接種到TSA斜面純化后，將其接種到組胺選擇性培養基，發現有5株菌呈組胺陽性反應，分別編號為菌株1～5并進行理化特性分析。

2.2 菌株理化特性

表1顯示，菌株1～5均為革蘭氏陰性菌，菌株1、2 為非運動性，菌株 3、4、5 具有運動性，5 株菌均不產硫化氫，不能利用肌醇、山梨醇和核糖醇。根據表1理化特性分析結果參照《常見細菌系統鑒定手冊》[12]和《伯杰細菌鑒定手冊》[13]，初步確定 5株菌分別為哈夫尼菌屬（Hafnia）、志賀氏菌屬（Shigella）、變形菌屬（Proteus Hauser）、沙雷鐵氏菌屬（Serratia）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。

表1 菌株鑒定結果Table 1 Identification results of 5 isolated strains

2.3 不同培養溫度對分離菌株組胺產生能力的影響

圖1顯示，分離出的5株菌均有較強的組胺產生能力，培養24 h組胺質量濃度在6.27～26.77 mg/mL之間。溫度對菌株1～5組胺產生能力均有顯著（p＜0.05）影響，20、25和36℃溫度下各菌株組胺產生能力較高，其最適溫度分別為20、36、36、20和25℃，培養 24 h后組胺質量濃度分別為 24.87、23.12、21.47、26.77和24.52 mg/mL，表明此5株菌均為嗜溫菌且組胺產生能力較強。圖1還顯示，盡管4℃低溫下各菌株組胺產生能力受到顯著 （p＜0.05）抑制，但經24 h培養后組胺質量濃度仍達到較高水平（7.62～13.67 mg/mL），這可能與秋刀魚在4℃低溫貯藏條件下組胺含量仍快速上升有關。需要特別指出的是，30℃溫度下各菌株組胺產生能力均顯著（p＜0.05）降低，其中菌株1和菌株4組胺質量濃度甚至低于4℃，表明30℃不適合此5株菌產生組胺。

圖1 不同培養溫度對分離菌株組胺產生能力的影響Fig.1 Effects of different incubation temperatures on the histamine producing capacity of 5 isolated bacteria

2.4 不同pH值和培養時間對分離菌株組胺產生能力的影響

圖2顯示，菌株1～5在pH值4.5～8.5范圍內均能代謝產生組胺，pH值和培養時間對菌株1～5組胺產生能力有顯著（p<0.05）影響，各菌株分別在pH值為 8.5、7.5、6.5、6.5 和 7.5 的條件下培養 72 h 后表現出最大組胺質量濃度，pH值4.5～5.5對各菌株組胺產生能力有顯著（p<0.05）抑制作用，表明該5株菌適宜在pH值6.5～8.5條件下生長產生組胺。需要特別指出的是，盡管菌株1～5在大多數pH值條件下，組胺產生量隨培養時間的延長逐漸增加，但在少數pH值下有下降現象，如菌株1在pH值4.5和5.5、菌株2和菌株3在pH值6.5、菌株4在pH值4.5、菌株5在pH值4.5和7.5，是取樣誤差還是實驗錯誤，具體原因值得進一步研究。

圖2 不同pH值和培養時間對分離菌株組胺產生能力的影響Fig.2 Effects of different pH value and incubation time on the histamine producing capacity of 5 isolated bacteria

3 討論

研究發現一些細菌體內具有較強活性的脫羧酶，可催化青皮紅肉魚類中的組氨酸脫羧而產生組胺，當魚鮮度下降甚至腐敗后就會產生大量組胺，食用過量的組胺便有中毒的危險，因此大量的研究也主要集中在組胺菌分離鑒定及其理化特性等方面[14]。表2總結了近年來科研人員在不同水產品中分離鑒定出的組胺菌，其中腸桿菌屬（Enterobacteriaspp.）、 假單胞菌屬 （Pseudomonasspp.）、 摩根菌屬（Morganellaspp.）、檸檬酸桿菌屬（Citrobacterspp.）、肺炎桿菌屬 （Kielbasasspp.）、 芽孢桿菌屬（Bacillus）、 弧菌屬 （Vibriospp.） 和葡萄球菌屬（Staphylococcus）是水產品中發現較多的組胺菌屬，在適宜環境條件下這些菌的組胺產生能力大多能達到1 mg/mL以上，表明這些菌是導致青皮紅肉魚類組胺中毒的主要細菌，在貯藏及生產加工過程中應進行重點控制。此外，變形桿菌（Proteus vulgaris）、雷氏普羅威斯登菌（Providencia rettgeri）、嗜鹽鏈球菌（Tereagenococcus halophilus）和解鳥氨酸拉烏爾菌（Raoultella ornithinolytica）在少數水產品中也有發現，且具有較強的組胺產生能力。本實驗從不新鮮的秋刀魚中不僅分離到假單胞菌屬（Pseudomonas）和變形菌屬（Proteus Hauser），而且還分離獲得3株新的組胺菌，分別為哈夫尼菌屬（Hafnia）、志賀氏菌屬 （Shigella）和沙雷鐵氏菌屬（Serratia），在適宜培養條件下5株菌的組胺產生能力均高達20 mg/mL以上，這可能是秋刀魚容易腐敗變質的重要原因。

溫度和pH值是影響組胺菌產生組胺的重要因素，不同組胺菌適宜的溫度不同，同時受環境中氫離子濃度的影響。從表2可知，大部分組胺菌的適宜溫度和pH值分別在20～36℃和6.5～7.5范圍之間，屬于中溫菌，且適宜在中性偏堿性環境中生長產生組胺。研究表明，低溫和pH值5.5以下酸性環境能抑制水產品中組胺菌的活動從而減少組胺的產生。童玲等[6]研究發現，在0和4℃環境下，扁舵鰹中腸桿菌科 （Enterobacteriaceae）、假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）和弧菌屬（Vibriospp.）等組胺菌生長繁殖受到抑制，其中弧菌屬在5 d貯藏期間幾乎停止生長。本實驗研究獲得的5株菌適宜溫度分別為 20、36、36、20和 25℃，適宜 pH 值分別為 8.5、7.5、6.5、6.5和7.5，與前人研究結果基本一致。然而，盡管4℃低溫顯著（p<0.05）抑制了5株菌組胺產生能力，但經24 h培養后仍能產生較高質量濃度的組胺，這與弧菌屬（Vibriospp.）在低溫下的反應不同。

根據目前已分離鑒定組胺菌的理化特性分析結果，不同組胺菌適宜的生長溫度、pH值及組胺產生能力大小均不相同，即使不同產品中分離得到的相同菌株其組胺產生能力也存在較大差異，尤其在凍藏（<-18℃）溫度下和腌漬過程中這些組胺菌的特性還知之甚少。在今后的研究中，通過分析不同組胺菌在-18℃或更低凍藏溫度條件下或低溫腌漬等過程中的生長及其理化特性，發現優勢組胺菌群并提出針對性的控制措施，對維持青皮紅肉魚類鮮度確保食用安全具有重要的意義。

表2 不同菌株組胺產生能力Table 2 Bistamine producing capacity of different bacteria

4 結語

本研究分離獲得5株菌能產生組胺并初步鑒定為哈夫尼菌屬（Hafnia）、志賀氏菌屬（Shigella）、變形菌屬（Proteus Hauser）、沙雷鐵氏菌屬（Serratia）和假單胞菌屬（Pseudomonas）。5株菌在適宜的培養條件下均有較強的組胺產生能力，適宜培養溫度范圍為20～36℃，4℃下仍能產生大量組胺；在pH值4.5～8.5范圍內均能生長，適宜pH值范圍為6.5～8.5。以上結果為秋刀魚組胺菌控制提供了理論依據。