瑞香素對人類風濕關節炎滑膜成纖維細胞凋亡的影響及其與內質網應激的關系*

敖琴，劉俊，胡歡，李培霆，秦龍燕，蒙富雪，李龍*** ，曾家順***

(1.貴州醫科大學 臨床醫學院，貴州 貴陽 550004；2.貴州醫科大學附屬醫院 風濕免疫科，貴州 貴陽 550004；3.貴州醫科大學 第三附屬醫院，貴州 都勻 558000)

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、自身免疫性和多系統的炎癥性疾病[1]，病變主要侵犯四肢小關節，可促使滑膜增生、關節滑膜炎及骨與軟骨進行性破壞[2]，其中炎癥的產生以及骨和軟骨的破壞與滑膜成纖維細胞(fibroblast-like synoviocytes，FLS)腫瘤樣增殖相關，RA-FLS的異常增殖主要因為其具有抗凋亡的特性[3-5]。瑞香素(daphnetin，DAP)，又名祖師麻甲素，是一種香豆素類衍生物，具有抗炎、抗腫瘤及抗氧化等作用[6-8]。在膠原誘導性關節炎(collagen-induced arthritis，CIA)大鼠中，DAP可減弱輔助性T細胞2(helper T cell，Th2)、輔助性T細胞17(helper T cell，Th17)型應答，抑制白細胞介素1β(interleukin 1β，IL-1β)、白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)及白細胞介素12(interleukin 12，IL-12)的表達，從而起到抗炎作用[9-11]；DAP還可促進促凋亡基因死亡受體3(death receptor 3，DR3)、細胞程序性死亡受體5(programmed cell death 5，PDCD5)、人凋亡相關因子配體(human factor-related apoptosis ligand，FasL)和人抑癌基因P53去甲基化，增加細胞凋亡[12-14]。目前，DAP在炎癥性疾病中研究相對較少，且作用機制還未明確。本研究基于內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，探討DAP對人RA-FLS增殖、凋亡的影響，旨在進一步明確DAP作用機制，為將其應用于臨床提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細胞株 人類風濕關節炎成纖維樣滑膜細胞(人RA-FLS)，由貴州醫科大學第三附屬醫院中心實驗室蒙富雪老師惠贈，購于北京北納生物(BNCC340356)。

1.1.2主要藥物和試劑 DAP(上海源葉，純度≥98%)和Cell Counting Kit-8試劑盒(CCK-8，大連美倫)，胎牛血清和青霉素/鏈霉素(美國BI)，二甲基亞砜(中國索萊寶)，高糖Dulbeccos Modified EagleMedium(DMEM，美國Gibco)，兔多克隆抗體蛋白激酶R樣內質網激酶抗體(protein kinase-like ER kinase，PERK)、兔多克隆ERS相關蛋白葡萄糖調節蛋白78抗體(glucose regulated protein 78，GRP78)、兔多克隆凋亡蛋白C/EBP同源蛋白抗體(C/EBPhomologous protein，CHOP)及兔多克隆含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶12抗體(cysteinyl aspartate specific proteinase 12，Caspase12；武漢三鷹)，B細胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma gene-2，BCL-2；中國華安生物)，凋亡試劑盒(美國BD)。

1.1.3主要儀器 倒置顯微鏡(日本Nikon)，酶標儀(美國Thermo)，曝光機(美國Bio-rad)，培養箱(美國Biobase)，流式細胞儀(美國Beckman coulter)。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養 細胞培養于含15%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM培養基，培養箱條件為37 ℃、5%CO2，2 d換1次液，細胞長滿90%左右進行1∶3傳代。

1.2.2CCK-8檢查細胞存活率 取對數增長期細胞，按100 mL/孔加入96孔板，每組種4個孔，37 ℃、5%CO2培養箱孵育24 h，去掉培養基，用0(對照組)、10、20、30、40、50、60及70 mg/L DAP的培養基處理細胞，24 h后加CCK-8增強劑10 μL、孵育2 h，于酶標儀上波長460 nm處檢測吸光度(opticail density，OD)值，記錄結果，計算細胞存活率[細胞存活率(%)=(OD實驗組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組)×100%]，統計分析后以0、20、40及60 mg/L DAP為實驗分組，后續實驗分組相同。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡率 取對數增長期細胞接種于6孔板，按1.2.2項下分組處理24 h，冷磷酸緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌細胞2次，PE AnnexinV和7-AAD溶液避光染色15～30 min；流式細胞儀于30 min內對樣本進行檢測，數據用FlowJo V10軟件進行分析。

1.2.4免疫熒光檢測蛋白表達 提前在6孔板中放入細胞玻璃爬片，取對數增長期細胞接種于6孔板，待細胞貼壁后，0、20 mg/L DAP處理24 h；清洗、固定、通透、封閉，PERK、GRP78及Caspase12抗體稀釋液孵育過夜；次日清洗，熒光二抗避光孵育2 h，DAPI染色5 min，于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5Western blotting檢測蛋白表達 取對數增長期細胞接種于6孔板，按1.2.2項下分組處理24 h；PBS清洗細胞，常規方法提取總蛋白，通過蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進行定量；經蛋白變性、電泳及轉膜后，于5%脫脂奶粉封閉1.5～2.0 h，用PERK、p-PERK、GRP78、CHOP、Caspase-12、Bcl-2及GAPADH一抗4 ℃孵育過夜，次日清洗，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)偶聯的二抗處理2 h；顯色液將信號可視化，使用Image J進行灰度值定量分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 人RA-FLS增殖活性及濃度確定

經0、10、20、30、40、50、60、70 mg/L DAP處理RA-FLS 24 h后，CCK-8檢測各組細胞存活率，與0 mg/L DAP組比較，細胞的存活率隨DAP濃度增加而受抑制，差異有統計學意義(P<0.05)；當藥物質量濃度超過60 mg/L時，細胞存活率<50%；0、20、40及60 mg/L DAP組細胞存活率比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，因此0、20、40及60 mg/L DAP為后續實驗分組。見圖1。

注：(1)與0 mg/L DAP組比較，P<0.05；(2)與10 mg/L DAP組比較，P<0.05；(3)與20 mg/L DAP組比較，P<0.05；(4)與30 mg/L DAP組比較，P<0.05；(5)與40 mg/L DAP組比較，P<0.05；(6)與50 mg/L DAP組比較，P<0.05；(7)與60 mg/L DAP組比較，P<0.05。

2.2 人RA-FLSA凋亡

結果顯示與0 mg/L DAP組比較，在藥物處理培養24 h后，隨著DAP藥物濃度增加人 RA-FLS細胞凋率逐漸增大(P<0.05)，結果呈劑量依耐性改變。見圖2。

注：A～D分別為0、20、40及60 mg/L DAP組人RA-FLS細胞凋亡的流式圖，E為細胞凋亡率的定量結果；(1)與0 mg/L DAP組比較，P<0.05；(2)與20 mg/L DAP組比較，P<0.05；(3)與40 mg/L DAP組比較，P<0.05。

2.3 免疫熒光檢測人RA-FLS細胞ERS相關蛋白表達

采用免疫熒光的方式初步觀察ERS相關蛋白在DAP處理細胞后的表達情況，結果顯示，20 mg/L DAP組處理的人RA-FLS細胞中PERK、GRP78及Caspase-12熒光強度均高于0 mg/L DAP組。見圖3。

注：A、B、C分別為PERK、GRP78及Caspase-12的蛋白表達；藍色為細胞核顯色，綠色為目的蛋白熒光顯色。

2.4 Western blot 檢測ERS相關蛋白的表達

Western blot檢測結果顯示，與0 mg/L DAP組比較，其余質量濃度DAP組對人RA-FLS細胞中ERS相關蛋白PERK、p-PERK、GRP78、CHOP及Caspase-12表達隨DAP質量濃度增加而增加，差異均有統計學意義(P<0.05)；與0 mg/L DAP組比較，其余質量濃度DAP組對人RA-FLS細胞中ERS抑制凋亡蛋白Bcl-2的表達隨質量濃度增加而減少，差異均有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

注：A、B分別為PERK、p-PERK及GRP78蛋白電泳和定量表達結果，C、D分別為CHOP、Caspase12及Bcl-2的蛋白電泳和定量表達結果；(1)與0 mg/L DAP組比較，P<0.05；(2)與20 mg/L DAP組比較，P<0.05；(3)與40 mg/L DAP組比較，P<0.05。

3 討論

甲氨蝶呤、羥氯喹目前作為RA在臨床上常用藥[15]，能快速緩解疾病癥狀，再加上生物制劑的加持，使得RA的治療更近一步改善，患者病情可得到極大控制,但部分患者因個體差異對藥物的敏感性及耐藥性的不同，療效不一，還會出現不同程度副作用[16-18]。因此，找到一種合適、更有效的治療方式是至關重要的[19]。近年來，中草藥類藥物研發和應用不斷發展，與化學類藥劑相比，具有毒性及副作用小的優勢，因此發掘中草藥類抗炎制劑將更加造福于人類[20-22]。已有相關研究表明，DAP在CIA中可調節輔助性T(helper T cell，Th)細胞，并通過線粒體自噬途徑調節CIA小鼠FLS炎癥介質表達、促進其凋亡[23-25]。本研究結果顯示，DAP可成劑量依耐性地誘導人RA-FLS細胞凋亡，與前期誘導CIA-FLS凋亡結果一致。

ERS是細胞自我調節功能的體現，適當的應激可通過ERS提高細胞存活率，起到細胞保護作用，但當過度刺激超過內質網自身調節能力時，ERS反而加重細胞內環境穩態的不平衡，通過誘發下游凋亡信號通路，從而導致細胞凋亡[26]。PERK/GRP78/CHOP是ERS中的一條通路，可介導下游凋亡基因的表達，當啟動ERS時，PERK與GRP78解離，以磷酸化活性狀態激活下游CHOP、Caspase-12及Bcl-2表達，促進細胞凋亡[27-29]。本研究首先通過免疫熒光初步檢測20 mg/LDAP對人RA-FLS細胞ERS相關蛋白表達的影響，再通過蛋白印記進一步定量印證，結果顯示，20 mg/L DAP可上調人RA-FLS細胞表達PERK、GRP78以及Caspase-12，對應的蛋白印記結果也進一步證明DAP可成劑量依耐性誘導ERS相關蛋白表達。

綜上所述，DAP對人RA-FLS的抑制作用可能與ERS介導的凋亡相關，但本研究僅先探討DAP在人RA-FLS細胞中與ERS的初步聯系，后續仍需加入抑制劑進行驗證，同時還需進一步在動物體內加以研究，深入探討潛在分子機制，為DAP治療RA提供更具說服力的理論支撐。