家蠶5齡幼蟲中腸磷酸酶活性分析

唐芬芬

摘要? ? 以家蠶為試驗(yàn)材料，調(diào)查了5齡幼蟲從起蠶到熟蠶中腸酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）酶活性變化。結(jié)果表明，AKP酶活性呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)，其中在5齡起蠶和熟蠶時(shí)酶活性較低，而在盛食期（5齡第5天）活性最高;而ACP在5齡初期酶活性較低，從5齡第4天開始升高，隨后維持在一個(gè)較高的水平上。

關(guān)鍵詞? ? 5齡家蠶;中腸;酸性磷酸酶;堿性磷酸酶;酶活性

中圖分類號(hào)? ? S883? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? ? A

文章編號(hào)? ?1007-5739（2019）17-0224-02? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）

磷酸酶是一類能分解磷酸酯的水解酶，昆蟲機(jī)體存在2種磷酸酶（Phosphatase），一種是酸性磷酸酶（Acid Phos-phatase，ACP），另一種是堿性磷酸酶（Alkaline phosphatase，AKP）。酸性磷酸酶（ACP）在酸性條件下催化磷酸單酯水解和磷酸基因的轉(zhuǎn)移，在生物體代謝調(diào)節(jié)、能量轉(zhuǎn)化、信號(hào)傳導(dǎo)以及蛋白（酶）的去磷酸化等過程發(fā)揮重要作用[1]。該酶不僅參與昆蟲中腸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收、運(yùn)輸，而且是生物體內(nèi)重要的解毒物質(zhì)，廣泛存在于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)，是一種對(duì)底物專一性較低的磷酸單酯水解酶;同時(shí)，在生物體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)代謝中具有重要的生物學(xué)功能。ACP在細(xì)胞內(nèi)主要存在于溶酶體中，在細(xì)胞核、胞液、微粒體、高爾基體中也有存在[1]。堿性磷酸酶（AKP）是一類非特異性磷酸水解酶，該酶廣泛存在于人、動(dòng)物、植物與微生物中，在生物體內(nèi)直接參與了磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移和代謝過程，在對(duì)殺蟲劑的抗性形成和對(duì)內(nèi)源或外源化合物（包括植物產(chǎn)生的次生物質(zhì)）的解毒代謝方面起著重要作用[2-3]。家蠶ACP主要參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收、運(yùn)輸，在蠶絲蛋白合成中也發(fā)揮了重要作用[4]。昆蟲的中腸是分泌眾多酶類的組織，也是消化吸收營(yíng)養(yǎng)的主要部位[5]。本試驗(yàn)以5齡家蠶幼蟲為研究對(duì)象，測(cè)定了家蠶整個(gè)5齡期中腸ACP和AKP的酶活性，為深入了解家蠶中腸磷酸酶的變化規(guī)律提供參考。

1? ? 材料與方法

1.1? ? 試驗(yàn)材料

供試家蠶品系為菁松×皓月，于恒溫培養(yǎng)箱26 ℃桑葉飼養(yǎng)至5齡。取5齡起蠶（標(biāo)記為0 d）至熟蠶（標(biāo)記為7 d）的中腸，每次取樣均設(shè)3次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)取5頭蠶，樣品收集后置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2? ? 酶液制備及活性測(cè)定

酶液的制備：取家蠶中腸樣品，加入4 ℃預(yù)冷的1.0 mL磷酸鉀緩沖液（0.1 mol/L，pH值7.0），在冰上勻漿，4 ℃條件下、8 000 r/min離心5～8 min，收集上清液。按照南京建成生物科技有限公司ACP測(cè)試盒（貨號(hào)：A060）和AKP（貨號(hào)：A059-1）測(cè)試盒說明書測(cè)定酶ACP和AKP活性。

蛋白質(zhì)含量測(cè)定：參照楊偉克等[6]的方法，其主要測(cè)定原理是蛋白質(zhì)分子具有-NH3+基團(tuán)，當(dāng)棕紅色考馬斯亮蘭顯色劑加入到蛋白標(biāo)準(zhǔn)液或樣品中時(shí)，考馬斯亮蘭染料上的陰離子與蛋白-NH3+結(jié)合，使溶液變?yōu)樗{(lán)色，通過測(cè)定595 nm處吸光度可計(jì)算出蛋白含量。每個(gè)樣品重復(fù)3次，取其平均值，下同。計(jì)算公式如下：

待測(cè)樣品蛋白濃度（g/L）=[（測(cè)定OD值-對(duì)照OD值）/（標(biāo)準(zhǔn)OD值-空白OD值）]×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（0.563 g/L）

2? ? 結(jié)果與分析

在家蠶整個(gè)5齡期不同發(fā)育階段中腸磷酸酶活性變化如圖1所示。從圖1可以看出，家蠶5齡幼蟲從起蠶到熟蠶，堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性變化并不一致。AKP酶活性表現(xiàn)為先升后降的變化趨勢(shì)，5齡起蠶（第0天）AKP酶活力最低，在第1天和第2天AKP活力略有增加，從第3天酶活力開始逐漸升高，在第5天酶活力最高（28.95 U），在第7天急劇下降至5.19 U，略高于起蠶。ACP酶活性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，從5齡起蠶至第3天，酶活性較低，在第4天開始增加，此后就維持在一個(gè)較高的水平上。

3? ? 結(jié)論與討論

酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）是一類能分解磷酸酯的水解酶，廣泛存在于昆蟲體內(nèi)，在昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆性方面都發(fā)揮了重要作用[2]。中腸是家蠶的重要組織之一，主要負(fù)責(zé)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化與吸收，桑葉中的糖類、蛋白質(zhì)和脂類等大分子化合物首先在中腸消化液的作用下分解成小分子化合物，經(jīng)中腸上皮細(xì)胞吸收，再通過血液運(yùn)輸?shù)狡渌M織[7-8]。家蠶中腸磷酸酶（ACP和AKP）活性與家蠶的生理狀況密切相關(guān)，在一定程度上反映了中腸對(duì)桑葉等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消化吸收能力的強(qiáng)弱[9]。

本研究結(jié)果顯示，堿性磷酸酶（AKP）活力在家蠶的整個(gè)5齡期呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，其活性變化規(guī)律與該齡期家蠶的食量及生理進(jìn)程趨于一致。5齡家蠶一般在第4～5 天達(dá)到盛食期，AKP酶活性即在第5天相對(duì)較高，盛食期家蠶對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的需求量很大，攝食量增加，AKP酶活性此時(shí)維持一個(gè)相對(duì)較高的水平，主要參與中腸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝吸收。酸性磷酸酶（ACP）酶活性呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì)，在5齡初期較低，后期就維持在一個(gè)較高水平上。在5齡中期以前，食用的桑葉蛋白質(zhì)以用于初蠶生長(zhǎng)為主，5齡后期，蠶體生長(zhǎng)已基本完成，繼續(xù)食用一定量的桑葉合成氨基酸和蛋白質(zhì)，用于吐絲營(yíng)繭。ACP酶活性從5齡第4天開始急劇增強(qiáng)，隨后維持一個(gè)較高的水平，表明ACP在5齡家蠶后期絲蛋白的合成以及磷酸物質(zhì)的轉(zhuǎn)移、消化、吸收等方面發(fā)揮重要作用。

4? ? 參考文獻(xiàn)

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