高脂日糧對肥胖易感和肥胖抵抗小鼠骨性能的影響以及槲皮素的干預作用

周銀芝，夏淑芳，段曉梅，顏 彪，施用暉，2，樂國偉*，2

（1.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122；2.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122）

骨質疏松癥和肥胖這兩種身體組成紊亂的疾病在全球范圍內正以高比例增長[1]。但是關于肥胖對骨骼的影響還存在爭議。機械負荷可以通過減少細胞凋亡促進成骨細胞和破骨細胞分化來促進骨形成[2]。由高體重產生的機械負荷使得人們普遍認為肥胖可以預防骨丟失和骨質疏松[3]。然而Compston等人發現，肥胖不僅不會保護更年期婦女不得骨質疏松癥，反而會增加她們股骨骨折的風險[4]。經骨密度校正后，較高的體重是所有骨質疏松性骨折的危險因素[5]。

肥胖患者有較高的完全代謝率，機體的氧化應激程度增加[6]。肥胖個體通過抗氧化酶水平降低表現出抗氧化防御系統降低[7]，降低體重對于減輕氧化應激是十分重要的[8]。高脂日糧刺激下，伴隨著肥胖發生，小鼠股骨發生氧化應激并誘發骨代謝失衡[9]。具有抗氧化功能的功能因子可以有效緩解氧化應激。硫辛酸可通過清除自由基、調整氧化還原狀態，改善小鼠肝臟脂代謝功能[10]，槲皮素可有效提高機體抗氧化能力，緩解高脂膳食造成的氧化應激，改善血脂代謝[11]。高脂膳食下的肥胖抵抗、中等體重、肥胖易感三種肥胖表型小鼠血液CAT、TAOC均比正常膳食小鼠顯著下降，MDA含量顯著增加，血漿低密度脂蛋白含量也呈顯著上升的趨勢，而肥胖抵抗小鼠氧化應激程度比肥胖小鼠相對減輕[12]。因此將肥胖抵抗和肥胖易感小鼠分開研究更能夠說明高脂日糧對小鼠股骨氧化還原狀態的影響。

作者通過飼喂高脂日糧誘導出肥胖易感和肥胖抵抗兩種表型，探究短期和長期飼喂高脂日糧的OP和OR小鼠的骨性能和股骨氧化還原狀態的變化。通過測定相關基因的表達進一步探究不同周期高脂日糧影響OP和OR小鼠骨性能的可能作用機制以及抗氧化功能因子槲皮素對此的干預作用，為肥胖抵抗和肥胖易感人群預防和干預骨質疏松提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑及儀器

槲皮素：純度為99%，美國sigma公司；牛血清蛋白：上海生工物程有限公司；氧化性谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG），還原性谷胱甘肽（glutathione，GSH）標準品：中國醫藥集團化學試劑有限公司；丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒：南京建成生物科技有限公司；熒光染料SBY：Bioneer公司 ；DEPC：Generay Biotech 公司 ；Trizol裂解液：美國Biomiga公司；反轉錄各種酶和緩沖液以及dNTPs：大連寶生物工程有限公司；基因引物：Generay Biotech公司；其余試劑均為分析純。In-Vivo DXS PRO全自動高分辨X光機：德國Bruker公司；手持式組織勻漿器PT1200：Kinematica公司；SpectraMax M5/M5e酶標儀：美國Molecular Devices公司；恒溫水浴鍋：上海精宏實驗設備有限公司；XB70制冰機：美國GRANT公司；Forma超低溫冷凍冰箱：美國Thermo公司；AB204-N分析天平：梅特勒-托利多公司；STARTER 3100實驗室pH計：上海奧豪斯儀器有限公司。

1.2 實驗動物和喂養

110只3周齡C57/BL6雄性小鼠，購自南京大學模式動物研究所，隨機分為飼喂正常日糧的對照組（n=20），高脂日糧組（n=90），自由采食飲水，飼養溫度 （23±2）℃，濕度60%，12/12小時晝夜循環光照。7 w后，將飼喂高脂日糧的小鼠按體重從低到高排序，體重最低的1/3稱為肥胖抵抗（obesity resistant，OR，n=10），體重最高的 1/3 的稱為肥胖易感（obesity prone，OP，n=10），處死。 第二批，高脂飼喂7 w分出OR和OP后，給肥胖和抵抗小鼠的高脂日糧中均添加0.4%槲皮素得到肥胖易感+槲皮素組（OP+Q，n=10）和肥胖抵抗+槲皮素組（OR+Q，n=10），只喂高脂日糧不添加槲皮素的稱為肥胖抵抗高脂對照組（OR，n=10），肥胖易感高脂對照組（OP，n=10），17周末處死小鼠。飼料配方見表1。

表1 飼料配方Table 1 Composition of diets

1.3 實驗方法

1.3.1 組織樣品制備各組小鼠禁食12 h，乙醚麻醉后斷頸法處死小鼠，在冰浴上迅速取出股骨和脛骨；用生理鹽水中浸泡過的紗布將左腿股骨擦除多余的附著組織后，取部分添加0.9%的預冷生理鹽水制備10%的勻漿液，置于-20℃備用；剩余左腿股骨至于Trizol中用于RNA提取；其余樣品液氮冷凍后置于-80℃超低溫冰箱保存。

1.3.2 氧化還原狀態指標測定MDA、T-AOC測定均按照南京建成生物科技有限公司試劑盒說明書操作。GSH和GSSG含量用熒光分光光度法測定。

1.3.3 總RNA提取及qRT-PCR用生理鹽水中浸泡過的紗布擦除股骨上附著的組織后至于1 mL Trizol中，用滅酶剪刀將股骨剪碎，再用滅過酶的電動勻漿器冰浴勻漿。勻漿后放置15 min后，10 000 r/min離心15 min。吸取離心后的上清液加入200 μL氯仿混勻，靜置15 min后，10 000 r/min離心15 min。吸取上層水相400 μL，加入等體積的-20℃預冷的異丙醇和等體積預冷鹽溶液，混勻4℃沉淀過夜。其余操作按照Trizol法提取股骨總RNA，反轉錄得到 cDNA。實時熒光定量 PCR（quantitative Real-time PCR）檢測小鼠股骨mRNA水平，引物序列見表2。

表2 引物序列Table 2 Sequences of the primers

1.3.4 骨性能參數測定在生理鹽水中浸泡過的紗布擦除右腿股骨附著的組織后，測定以下指標。

骨密度：用In-Vivo DXS PRO全自動高分辨X光機測定股骨密度；骨長度（length，mm）：用游標卡尺測定股骨頭的近側端至遠側末端；骨徑：用游標卡尺測定骨干中點；骨強度（N）：采用質構儀進行三點彎曲試驗，將樣品置于支撐架上，固定兩端，跨距6 mm，探頭加載速度10 mm/s直至股骨斷裂獲得最大載荷值；骨干質量 （dry weight，mg）：將股骨于105℃常壓烘干至恒質量；灰分重（mg）：將股骨置于坩堝中，在電爐上碳化至不再產生黑煙后，放于恒質量后的坩堝中在馬弗爐中550℃灰化至恒質量，計算灰分含量；股骨鈣質量分數（mg/g dry weight）：EDTA滴定法測定鈣含量；股骨磷質量分數（mg/g dry weight）：釩鉬酸銨比色法。

2 結果與分析

2.1 高脂日糧不同周期肥胖易感和肥胖抵抗小鼠骨性能的變化

2.1.1 短期高脂日糧對OR和OP小鼠骨性能的影響由表3可知，飼喂高脂日糧7 w時OP組小鼠的體質量顯著高于C組和OR組（P＜0.05），并且達到了C組小鼠體質量的1.2倍以上，出現了肥胖易感和肥胖抵抗兩種表型。

OR組小鼠股骨礦物質密度、生物力學性能指標骨強度、直徑、灰分質量、干質量、股骨鈣質量分數均顯著低于C組（P<0.05），骨長度與C組相比無顯著性差異。提示短期飼喂高脂日糧會使降低OR小鼠的骨性能。

OP組小鼠體質量顯著高于C組小鼠，其股骨灰分質量、骨干質量顯著高于C組小鼠（P＜0.05），其礦物質密度、骨強度、股骨鈣含量、骨長度分別比C 組高出 11.7%、3.1%、1.6%、13.4%（P>0.05）， 提示高脂日糧會使OP小鼠的骨性能升高。有研究表明，短期高脂日糧喂養會使生長期小鼠的骨性能增加，骨量變大，但是經體重校正后的骨密度和骨強度都呈下降趨勢[13]，骨量較大并不意味著骨性能更好[2]，肥胖小鼠骨性能增加“可能是為了支持過重體質量的代償反應”[13]。OP組小鼠的骨密度和骨強度經體質量校正后的骨密度/體質量（BMD/Weight）、骨強度/體質量 （Strength/Weight）值低于OR組和C組（P>0.05）。提示OP小鼠雖然骨量增加但是骨性能有下降的趨勢，結果見表3。

表3 短期高脂日糧肥胖易感和肥胖抵抗小鼠的骨性能（x±s，n=10）Table 3 Femur parameters of OR and OP mice after short term HFD（x±s，n=10）

2.1.2 長期高脂日糧對OR和OP小鼠骨性能的影響由表4可知，飼喂高脂日糧17周時，OR和OP小鼠的體重均顯著高于C組小鼠（P<0.05），說明OR小鼠對肥胖的抵抗能力是有限的，長期飼喂高脂日糧OR小鼠的體質量會顯著升高。

飼喂高脂日糧17周時，OR組小鼠的骨礦物質密度、生物力學性能指標骨強度、直徑、灰分質量、干質量、股骨鈣質量分數都顯著低于C組 （P<0.05），提示長期飼喂高脂日糧會影響OR小鼠股骨的生長，降低OR小鼠的骨性能。

飼喂高脂日糧17周時，OP組小鼠的股骨骨長度和直徑與C組小鼠相比無顯著差異（P>0.05）。但是其股骨的鈣質量分數、骨強度、骨密度均低于C組小鼠（P<0.05），提示長期飼喂高脂日糧，對OP小鼠股骨的生長無顯著性影響，但是會使OP小鼠的股骨性能降低，經體重校正后，OP組小鼠的骨強度，骨密度均顯著低于OR組和C組小鼠。

添加0.4%的槲皮素，OR+Q組小鼠的體質量相對OR小鼠沒有顯著性變化，其股骨礦物質密度、骨強度、灰分質量均恢復到C組水平；OP+Q小鼠的體質量顯著低于OP小鼠，仍顯著高于C組小鼠，OP+Q組小鼠股骨礦物質密度、骨強度、干質量、股骨鈣質量分數均得到恢復，見表4。

2.2 高脂日糧不同周期肥胖易感和肥胖抵抗小鼠股骨氧化還原狀態的變化

如表5所示，和C組相比，OP組和OR組小鼠股骨抗氧化能力指標T-AOC和GSH/GSSG均水平顯著降低（P<0.05），脂質過氧化物標志物MDA水平顯著升高（P<0.05），表明OP和OR小鼠股骨抗氧化能力降低，氧化還原狀態失衡。OR小鼠抗氧化指標均高于OP小鼠 （P>0.05），MDA水平高于OP小鼠（P>0.05），說明OP小鼠抗氧化應激的能力比OR小鼠低，此結果與OP組小鼠的骨密度/體質量、骨強度/體質量低于C組和OR組小鼠一致。

表4 長期高脂日糧周肥胖易感和肥胖抵抗小鼠的股骨性能（x±s，n=10）Table 4 Femur parameters of OR and OP miceby long term HFD（x±s，n=10）

表5 短期高脂日糧股骨氧化還原狀態（x±s，n=10）Table 5 Femur redox statebyshort term HFD（x±s，n=10）

17周時，和C組相比，OR組小鼠和OP組小鼠抗氧化能力指標T-AOC和GSH/GSSG水平均顯著降低（P<0.05），脂質過氧化物標志物MDA水平均顯著升高（P<0.05），說明長期高脂日糧破壞OR和OP小鼠股骨抗氧化應激的能力。添加0.4%槲皮素后，OR和OP組小鼠股骨氧化還原狀態均得到恢復，見表6。

表6 長期高脂日糧股骨氧化還原狀態（x±s，n=10）Table 6 Femur redox statebylong term HFD（x±s，n=10）

2.3 高脂日糧不同周期肥胖易感和肥胖抵抗小鼠成骨和破骨相關基因表達

骨骼是一個不停更新的活躍器官，骨骼的更新是一個包含破骨細胞骨吸收，成骨細胞骨形成的過程[14]。所以骨量可以在任何時期反映骨形成和骨吸收之間的平衡[15]。Runx2是一種轉錄激活因子，是成骨細胞分化所必需的[16]，能促進間充質干細胞的成骨分化過程并調節成骨細胞的成熟，Runx2基因敲除小鼠成骨細胞無法分化，軟骨無法礦化[17]。Bglap2是成骨細胞成熟的標志物，監測它的表達可以監測成骨細胞的分化[18]。RANKL正常情況下由成骨細胞合成，與破骨細胞及其前體表達的RANK結合，促進破骨細胞前體向破骨細胞分化并抑制破骨細胞凋亡，造成骨吸收增加。OPG由成骨細胞分泌，其作為RANKL的誘騙受體，與RANKL結合后使后者不能發揮作用，OPG是骨吸收強抑制劑，RANKL的天然拮抗劑[19]。RANKL/OPG上升破骨細胞的數量增加活性增強。組織蛋白酶K（cathepsin K，CTSK）是破骨細胞重要的功能分子，參與降解骨有機基質，并可以通過調控破骨細胞凋亡控制破骨細胞數量，高脂膳食小鼠中骨吸收和破骨細胞分化增強可能與CTSK表達上調有關。高脂日糧造成骨組織氧化應激，骨組織表現出低的抗氧化能力、氧化還原狀態向氧化態改變、ROS水平升高[20]。抗氧化功能因子槲皮素能夠效提高機體抗氧化能力，緩解高脂日糧造成的氧化應激，改善血脂代謝[11]。核因子E2相關因子 2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）是調節抗氧化應激反應的重要轉錄因子，在機體氧化還原狀態穩態的維持中起關鍵作用。Nrf2能夠通過清除ROS維持骨重建平衡[21]。醌氧化還原酶（NADPH quinine oxidoreductase，NQO1）是Nrf2的下游抗氧化酶基因，NQO1能夠增強飼喂高脂日糧小鼠骨組織的抗氧化能力[22]。

2.3.1 7 w肥胖易感和肥胖抵抗小鼠成骨和破骨相關基因表達如圖1所示，與C組相比，高脂日糧7 w時，OR組小鼠Bglap2、Runx2的表達無顯著變化，RANGKL/OPG、CTSK 的表達均顯著上調（P＜0.05），而 Nrf2、NQO1 的表達顯著上調（P＜0.05）。 提示短期飼喂高脂日糧能夠上調OR小鼠破骨細胞形成相關基因的表達，打破骨重建平衡，從而降低OR小鼠的骨性能。OR小鼠股骨Nrf2被激活，上調下游基因NQO1的表達來提高股骨的抗氧化能力。

圖1 短期高脂日糧OR和OP小鼠相關基因的表達Fig.1 Gene expressions of OR and OP mice after short term HFD

與C組相比，OP組小鼠Runx2、Bglap2的表達分別顯著上調 1.34和 1.49倍 （P<0.05），RANGKL/OPG、CTSK的表達分別上調 2.56和 2.25倍 （P<0.05），提示短期飼喂高脂日糧，OP小鼠可能通過增強成骨提高骨性能，破骨細胞分化水平高于成骨細胞分化水平導致骨性能有下降的趨勢，與骨性能的結果具有一致性。Nrf2、NQO1的表達均顯著下調（P<0.05），提示短期飼喂高脂日糧OP小鼠股骨已經出現嚴重氧化應激。Nrf2、NQO1下調可能導致破骨基因RANGKL/OPG，CTSK的表達上調，導致骨性能降低。

2.3.2 17 w肥胖易感和肥胖抵抗小鼠成骨和破骨相關基因表達如圖2-3所示，高脂日糧17 w時，與C組相比，OR組小鼠Bglap2、Runx2的表達顯著下調（P＜0.05），RANGKL/OPG、CTSK 的表達顯著上調 （P＜0.05）， 而 Nrf2、NQO1的表達顯著下調 （P＜0.05）。提示長期高脂日糧能夠通過增強破骨細胞分化相關基因的表達，抑制成骨細胞分化相關基因和氧化還原相關基因的表達降低肥胖抵抗小鼠骨性能。

圖2 長期高脂日糧OR小鼠相關基因的表達Fig.2 Gene expressions of OR mice after long term HFD

添加0.04%的槲皮素后，與C組相比，OR+Q組小鼠 Runx2的表達顯著上調 （P＜0.05），RANGKL/OPG、CTSK 的表達顯著下調 （P＜0.05），Nrf2、NQO1的表達顯著上調（P＜0.05）。提示槲皮素能通過增強骨骼的抗氧化能力，提高成骨細胞的分化，抑制破骨細胞的分化來改善肥胖抵抗小鼠的骨性能。

與C組相比，OP組小鼠Bglap2、Runx2的表達顯著下調（P＜0.05），RANGKL/OPG、CTSK 的表達顯著下調 （P＜0.05），而Nrf2、NQO1的表達顯著下調（P＜0.05）。提示長期飼喂高脂日糧能夠通過促進破骨細胞形成相關基因的表達、抑制成骨細胞形成相關基因和氧化還原相關基因的表達影響肥胖易感小鼠的骨性能。

圖3 短期高脂日糧OR小鼠相關基因的表達Fig.3 Gene expressions of OP mice after long term HFD

與C組相比，OP+Q組小鼠Bglap2、Runx2的表達顯著上調（P＜0.05），RANGKL/OPG、CTSK 的表達顯著下調 （P＜0.05），Nrf2、NQO1 的表達顯著上調（P＜0.05）。提示槲皮素能通過增強肥胖易感小鼠股骨的抗氧化能力，提高成骨細胞的分化，降低破骨細胞的分化來改善肥胖易感小鼠的骨性能。

3 討 論

高脂日糧喂養時，OR小鼠采食量顯著低于OP小鼠，但是OR小鼠的營養物質消化率顯著高于OP小鼠[11]，因此OR小鼠的體重較輕并不是因為營養物質攝入不足導致的，OR小鼠可能通過提高營養物質的消化率、控制采食量來控制體質量，本實驗研究發現OR小鼠這種能力是有限的，長期飼喂高脂日糧體質量也會增加。

本研究發現，短期飼喂高脂日糧的OR小鼠股骨抗氧化能力下降，破骨細胞分化水平升高，股骨骨徑變細，骨礦物質含量降低，骨密度、骨強度下降，骨性能降低，OR小鼠通過上調Nrf2、NQO1的表達來增強股骨的抗氧化能力。OP小鼠骨灰分含量和骨干質量顯著高于C組小鼠，其骨長度、鈣含量、骨強度、骨密度分別比C組高出3.1%、11.7%、13.4%、1.6%，但是經體質量校正的骨密度（BMD/Weight）、骨強度（Strength/Weight）均低于 C 組和 OR組（P>0.05），雖然沒有顯著統計學差異，但是呈現了低于C組和OR組的趨勢。基因結果顯示，OP小鼠成骨細胞分化水平升高，但是破骨細胞分化水平高于成骨細胞分化水平，Nrf2、NQO1的表達下調，TAOC和GSH/GSSG水平顯著降低（P<0.05），MDA水平顯著升高（P<0.05），股骨氧化還原狀態失衡，引起破骨細胞分化增強。Wang Luan等人的研究表明，肥胖對生長旺盛階段的幼鼠股骨骨量的增加不能充分代償體質量的增加[13]，由此推測OP小鼠可能通過增加成骨細胞分化來支撐過質量的體重帶來的機械負荷，但是股骨出現氧化應激引起破骨細胞分化增強，且高于成骨分化水平，所以OP小鼠校正后的骨性能有降低的趨勢。白靜[11]等人的研究發現，高脂日糧喂養的OR小鼠機體的抗氧化能力強于OP小鼠，這與我們短期高脂日糧的研究結果是一致的。飼喂短期高脂日糧時，OP小鼠的股骨抗氧化能力顯著低于OR組小鼠，解釋了OP小鼠經體重校正過的骨強度和骨密度均呈現低于C組和OR組小鼠的趨勢。

長期飼喂高脂日糧的OR和OP小鼠的骨性能各指標均顯著降低，成骨細胞分化水平均顯著降低，破骨細胞分化水平均顯著升高，股骨均出現氧化應激，骨性能均降低。肥胖抵抗小鼠早期有著更強的抵御氧化應激的能力，可被長期高脂飲食破壞[23]，飼喂高脂日糧17 w時，OR小鼠股骨的抗氧化指標降低，MDA水平顯著升高，且與OP小鼠無顯著差異，OR小鼠長期飼喂高脂日糧后股骨的抗氧化能力也被破壞。越來越多的研究表明，具有抗氧化功能的功能因子可以改善高脂日糧引起的氧化應激[10，24]，槲皮素可以通過減輕股骨的氧化應激，增加成骨細胞的分化，抑制破骨細胞的分化來提高骨性能，因此加入槲皮素進行干預后，OR和OP小鼠的氧化還原狀態和骨性能均得到恢復，槲皮素的作用機制還需進一步探究。

4 結語

綜上所述，高脂日糧會破壞肥胖易感和肥胖抵抗小鼠的股骨氧化還原狀態，引起氧化應激，飼喂短期高脂日糧OR小鼠抵御氧化應激的能力強于OP小鼠，OR小鼠骨性能呈現強于OP小鼠的趨勢。長期高脂日糧破壞了OR和OP小鼠抵御氧化應激的能力，兩種肥胖表型小鼠的骨性能均顯著降低。氧化應激可能通過影響成骨細胞分化和破骨細胞分化相關基因的表達，降低骨性能，添加槲皮素能通過減輕兩種小鼠的氧化應激提高骨性能。槲皮素在改善高脂飲食引起的骨質疏松方面具有潛在的應用前景。