多聚賴氨酸對雙亞基肌酸酶表面的修飾

高亞楠，辛 瑜，張 玲，楊海麟，王 武

（江南大學 工業生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

肌酸酶（creatinase；EC 3.5.3.3；CRE；分類名為肌酸瞇基水解酶，creatinase amidinohydrolase）屬于水解酶類，催化肌酸水解產生尿素和肌氨酸，是肌酐代謝中的關鍵酶。目前在多種細菌中均發現肌酸酶的存在，除了極少數來源的肌酸酶以單亞基的形式存在[1-2]，大多數肌酸酶都是同源二聚體，即由兩個相同的亞基組成[3-6]，其中對Pseudomonas putida來源的肌酸酶研究最多[3，7-12]，Yoshimoto等[3]人從Pseudomonas putida中純化出肌酸酶，并首次獲得酶結晶，該酶的特性研究表明，酶的相對分子質量為94 000，由2個相同的亞基組成，亞基相對分子質量為47 000。

血清和尿液中肌酐含量是診斷腎臟功能的重要指標，肌酸酶是酶法檢測肌酐含量的關鍵酶[13]。但是由于肌酸酶的穩定性較差，造成酶活性損失嚴重，限制了其工業化生產和應用。已有通過添加穩定劑、分子改造和固定化等方法提高肌酸酶穩定性的報道，Schumann等[10]研究了惡臭假單胞菌肌酸酶的穩定劑，發現在酶溶液中添加DTE、BSA或甘油能改善酶的穩定性，而進一步用隨機突變的方法對酶分子結構進行改造，得到了A109V、V355M、V182I、A109V+V355M 和 A109V+V355M+V182I 等5種突變體，穩定性均有所提高[11]；Berberich等[12]用聚氨酯固定化修飾放線桿菌來源的肌酸酶，提高了酶的儲存穩定性。

作者嘗試通過化學修飾法改善雙亞基肌酸酶的穩定性。多亞基酶失活的第一步通常是亞基解離，因此保護多亞基酶的首要目標是防止多亞基酶的解聚[14]。多聚賴氨酸是含有多個游離氨基的多聚物長鏈，可以與酶分子表面羧基相互作用形成穩定的共價鍵，環繞覆蓋在酶表面，起到分子捆綁的作用，使酶的空間結構更加緊密，從而提高酶的穩定性。作者選取Pseudomonas putida來源的具有兩個相同亞基的肌酸酶為研究對象，考察多聚賴氨酸對酶的修飾效果，該法對雙亞基肌酸酶熱穩定性提高具有一定的效果。

1 材料與方法

1.1 材料

3 500～4 500 的多聚賴氨酸（poly-lysine）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）：均購自Sigma；其他試劑均為國產分析純或色譜純試劑。重組E.coliBL21（DE3）/pET28a-CRE：由作者所在實驗室構建。

1.2 肌酸酶基因的表達與酶的純化

重組E.coliBL21（DE3）/pET28a-CRE 在 LB 培養基中于37℃培養過夜，種子液以體積分數5%轉接于新的LB培養基中，于37℃、200 r/min培養至OD達到0.6～0.8，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，并把溫度降至16℃，誘導培養16 h。8 000 r/min離心5 min收集菌體后，用pH 7.5、50 mmol/L的磷酸緩沖液重懸菌體，冰水浴超聲破碎菌體，破壁后8 000 r/min離心10 min，上清液即為粗酶液。采用載體上的組氨酸標簽，將粗酶液用鎳柱進行親和層析，獲得純酶液。

1.3 肌酸酶分子表面氨基酸分析

從PDB數據庫查找Pseudomonas putida來源的肌酸酶的結構（PDB ID：1CHM），然后用Pymol軟件對肌酸酶表面的酸堿性氨基酸的數目進行分析。

1.4 肌酸酶修飾正交試驗

以肌酸酶表面羧基與poly-lysine氨基摩爾比（A）、CRE-COOH 與 EDC的摩爾比 （B）、 反應 pH（C）為考察因素。4℃緩慢轉動混勻過夜，計算相對酶活力；將不同的摩爾比例獲得的修飾酶超濾除去未結合的小分子修飾劑，置于37℃恒溫水浴中，48 h后測定其酶活力，并計算其酶活力保留率。以相對酶活力與酶活保留率作為試驗指標，利用正交表L9（34）設定三因素三水平正交試驗，見表1。

表1 正交因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.5 肌酸酶的活性測定

單位酶活定義：1 min內將肌酸水解產生1 μmol尿素所需要的酶量[15]。

試劑配制：0.1 mol/L肌酸溶液 （以50 mmol/L磷酸緩沖液，新鮮配制）；對-二甲氨基苯甲醛溶液（溶2 g對-二甲氨基苯甲醛于100 mL二甲基亞砜中，然后加濃鹽酸15 mL）。

測定方法：在試管中加入0.9 mL肌酸溶液，室溫平衡5 min后加入0.1 mL待測酶液，在37℃反應10 min，然后向反應體系中加入2 mL對-二甲氨基苯甲醛溶液終止反應，并置于25℃溫育20 min，在435 nm處測定吸光度值[16]。

1.6 SDS-PAGE凝膠電泳分析

用最優方案對肌酸酶進行肌酸酶的poly-lysine修飾，用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對游離酶與修飾酶進行分析，推測poly-lysine對肌酸酶的修飾程度。

1.7 差示掃描量熱分析（DSC）

利用TA的Nano DSC差示掃面量熱儀研究游離肌酸酶及修飾酶的熱穩定性。取一定量的游離酶和修飾酶，使用磷酸緩沖液為基線，溫度掃描范圍為20～90℃，升溫速率為1℃/min。

1.8 動力學參數測定

用pH 7.5的50 mmol/L磷酸緩沖液配制濃度分別為10～100 mmol/L的肌酸溶液，于37℃反應10 min，測定游離酶和修飾酶在不同肌酸濃度時初始活力，得到反應速度V。根據Lineweaver-Burk雙倒數作圖法，以1/[S]為橫坐標，1/V為縱坐標作圖，分別計算酶游離酶與修飾酶的Km與kcat值。

1.9 穩定性分析

將游離酶溶液和修飾酶置于50 mmol/L磷酸緩沖溶液（pH 7.5）中，在不同的溫度（25、30、35、40、45和 50℃）下放置30 min，測定游離酶和修飾酶酶活力，以酶活力最高值為100%計算相對活性，確定酶的熱穩定性。

將游離酶溶液和固定化酶置于不同pH值的緩沖溶液（pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 和 10.0）中，25℃放置16 h，測定游離酶和修飾酶酶活力，以酶活力最高值為100%計算相對活性，確定酶的pH穩定性。

2 結果與討論

2.1 肌酸酶分子表面酸性氨基酸分析

多聚賴氨酸的共價修飾取決于酶表面的酸性氨基酸的個數，根據肌酸酶的氨基酸序列及結構（PDB ID：1CHM） 分析，Pseudomonas putida來源肌酸酶含有108個酸性氨基酸，其中76個酸性氨基酸位于酶分子的表面，且側鏈官能團暴露于酶表面，可以參與酶分子表面poly-lysine的修飾。

圖1 肌酸酶結構分析Fig.1 Structure analysis of creatinase

多聚賴氨酸修飾肌酸酶酶分子的途徑見圖2。首先采用EDC活化肌酸酶分子表面羧基生成EDC-羧酸中間體，該中間體與poly-lysine中游離的氨基相互作用形成共價鍵[17]。poly-lysine在肌酸酶表面形成共價修飾，以增強肌酸酶的穩定性。

圖2 poly-lysine表面修飾肌酸酶示意圖Fig.2 Modification of creatinase with poly-lysine

由于交聯類型不同，EDC活化肌酸酶后可以產生不同的交聯結構。poly-lysine分別在單個亞基上形成共價修飾；poly-lysine覆蓋跨越兩個亞基，使兩個亞基緊密結合在一起；酶分子間交聯。EDC是一種異型雙功能試劑，可能引起酶分子內或分子間的交聯，也會引起poly-lysine分子間的交聯[18]。

2.2 多聚賴氨酸修飾肌酸酶的條件優化

化學修飾反應過程中，酶與修飾劑的比例、活化反應、修飾反應的pH等均會影響修飾程度和修飾酶的性質。正交試驗中有兩個考察指標，它們是修飾酶的相對酶活力和修飾酶在37℃放置48 h后的酶活力保留率。根據綜合平衡法，先分別考察每個因素對各指標的影響，然后進行分析比較，確定出最好的水平。

修飾劑用量會影響酶的修飾率和修飾酶的性質。修飾劑用量越大，酶分子的修飾程度也越高。另一方面，酶表面偶聯的大分子修飾劑會產生空間位阻效應，使底物不易與酶活性中心相互作用而使酶活性下降[19]。從表2可知，對兩個指標來說，修飾劑用量是較次要的因素，對相對酶活力來講，取A2水平為最好，A3水平也不差，對酶活力保留率來講，取A3水平為最好，綜合考慮修飾劑用量取A3為最好，即CRE-COOH與poly-lysine-NH2的摩爾比為1∶100。

表2 正交試驗結果Table 2 Orthogonal test results

EDC可以與肌酸酶分子表面的羧基反應生成具有氨基反應活性的中間體，該中間體可以迅速與多聚賴氨酸中的游離氨基反應形成穩定的交聯產物，但該中間體在水溶液中是不穩定的，若不能及時與氨基反應，則會分解為原來的羧基[20]。對于酶表面羧基與EDC摩爾比，從相對酶活力來看，其影響力最小，取B1水平為最好，推測是由于高濃度的EDC會造成其在肌酸酶分子內部堆積，抑制酶活性位點與底物的結合，造成酶活力下降。從酶活力保留率來看，其極差最大，表明其對修飾酶的性質影響最大，取B3水平為最好。綜合EDC用量取B3水平為最好，即CRE-COOH與EDC的摩爾比為1∶10。

pH決定了酶蛋白中反應基團的解離狀態，設置不同的pH值，可以控制基團的解離程度，從而有利于修飾的專一性。pH值過低會造成酶活性損失，若pH值過高，在酶分子修飾過程中，不利于EDC活化肌酸酶表面的羧基，并且形成的中間體易發生水解反應[21]。對兩個指標綜合考慮，pH值取C2為最好，即最適反應pH為7.0。

綜合分析優化條件，CRE-COOH：poly-lysine-NH2取 1∶100，CRE-COOH：EDC 取 1∶10，pH 為 7.0。

2.3 修飾酶的SDS-PAGE鑒定

用十二烷基硫酸鈉（SDS）將蛋白質變性，在變性條件下，生物分子以變性的單體或亞基多肽-SDS復合體存在，單體或亞基多肽的分子質量差異造成了不同的遷移率。

如圖3，游離肌酸酶在SDS-PAGE中表現出單一條帶，單亞基相對分子質量為47 000，而修飾酶泳道出現多條帶，相對分子質量最小的條帶似乎略高于游離酶單亞基的位置，而高位條帶的相對分子質量甚至出現倍乘的現象。說明肌酸酶表面的羧基不同程度的與poly-lysine共價結合，形成穩定的交聯產物。

圖3 肌酸酶修飾的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE analysis of creatinase modified

2.4 修飾酶與游離酶酶學性質的比較

經修飾后酶的比酶活、Km、kcat與kcat/Km均減小。Km值的減小可能是由于底物肌氨酸與兩性離子型聚合物（poly-lysine）之間的相互作用，在底物結合區域維持較高的局部底物濃度，使得修飾酶與底物肌酸之間的親和力得到加強；但也可能會造成酶分子柔性的降低及底物擴散阻力增加，使得修飾酶kcat減小。修飾后的kcat/Km值減小，說明修飾后催化效率有所下降，導致比酶活降低，見表3。

表3 修飾酶與游離酶的動力學參數比較Table 3 Kinetic parameters parameters of the free and modified creatinase

2.5 修飾酶與游離酶的穩定性比較

差式掃描量熱法（DSC）一種熱分析方法，可以測定蛋白質分子的半解折疊溫度（Tm），分析其結構穩定性，以推測肌酸酶修飾后穩定性是否增加。結果表明，游離酶和修飾酶的熱變性溫度Tm分別為48.84℃和50.91℃，相同的升溫速率，修飾酶比游離酶的Tm值高了2.07℃。

肌酸酶經poly-lysine修飾前后熱穩定性的變化見圖4（a）。游離酶在35～45℃的環境下酶活隨著溫度的升高而迅速降低，在40℃時酶活已下降為30%以下，而修飾酶在40℃處理30 min，酶活保留率仍在50%以上。肌酸酶經修飾后熱穩定性明顯提高。修飾后pH穩定性也有了明顯的提高，見圖4（b）。在pH值為4.0和10.0時，修飾酶酶活力仍保留在50%以上，而游離酶幾乎沒有活性。

圖4 游離酶與修飾酶的熱穩定性與pH穩定性分析Fig.4 Thermal and pH stabilities of free and modified enzyme

推測poly-lysine修飾后，在肌酸酶酶表面形成“分子捆綁”作用，在一定程度上增強亞基間相互作用，多聚賴氨酸在單亞基表面形成覆蓋層，也可使得單亞基構象次級鏈得到保護，從而抵御不良環境對酶的破壞，提高酶的穩定性。

3 結 語

Pseudomonas putida肌酸酶為含兩個相同亞基的同源二聚體，采用相對分子質量4 000左右的poly-lysine對肌酸酶進行表面修飾，發現修飾酶的熱穩定性、pH穩定性均有不同程度的提高。SDSPAGE電泳檢測發現，poly-lysine分子捆綁后還出現了具倍乘關系的高相對分子質量肌酸酶聚合物的出現，可在進一步的研究中對其他修飾條件進行優化，例如調整poly-lysine的長度，肌酸酶的濃度等。本研究提供了一種新的提高肌酸酶穩定性的方法，并且也為其他多亞基酶的穩定性改造提供了一條可行的途徑。