轉(zhuǎn)錄因子FOSB mRNA 5′非翻譯區(qū)內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)的活性

馬 晶，孫柳柳，馬文囡，陶義芬，陳 蘊(yùn)，朱瑞宇，金 堅(jiān)

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214122）

小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物B（FBJmurine osteosarcoma viral oncogene homolog BFOSB或FOSB）是Fos轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，與細(xì)胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)化及腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。Fos家族包括4種轉(zhuǎn)錄因子：FOS、FOSB、FOSL1和FOSL2， 這些基因能夠編碼亮氨酸拉鏈蛋白，與其它蛋白質(zhì)形成同源或異源二聚體，二聚體與靶基因的堿性激活因子-1（Activatingprotein-1，AP-1）結(jié)合，以調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)[1]。FOSB基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物除全長(zhǎng)的FOSB外，還存在一個(gè)在C端比FOSB短101個(gè)氨基酸殘基的DeltaFOSB蛋白[2]，它是一種FOSB的較短的剪切形式，但比FOSB更為穩(wěn)定，在治療慢性上癮癥狀中扮演著重要的角色[3-6]。而FOSB基因不僅與藥物成癮相關(guān)，也與乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生有關(guān)，在誘導(dǎo)因子的作用下會(huì)引起三陰性乳腺癌細(xì)胞的死亡[7-9]。最近研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OSB基因有望成為血管內(nèi)皮瘤細(xì)胞及胃癌細(xì)胞的有效生物標(biāo)記物[10-11]，而對(duì)FOSB基因蛋白表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究，很少報(bào)道。

真核生物中經(jīng)典的翻譯機(jī)制是帽依賴型的翻譯起始機(jī)制，需要mRNA上的帽子結(jié)構(gòu)和真核翻譯起始因子來(lái)招募核糖體進(jìn)而起始翻譯。然而在病毒中，存在著另一種更為高效的翻譯起始機(jī)制，即非帽依賴型翻譯起始機(jī)制，其mRNA并沒(méi)有帽子結(jié)構(gòu)，核糖體的40S小亞基直接通過(guò)識(shí)別mRNA序列結(jié)構(gòu)或mRNA的5’非翻譯區(qū)（5’UTR）起始翻譯。其mRNA 5’UTR上核糖體能識(shí)別的序列稱為內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（（internal ribosme entry site，IRES）[12]。事實(shí)上，在真核生物中，也已發(fā)現(xiàn)許多轉(zhuǎn)錄因子的mRNA具有IRES活性，而這些轉(zhuǎn)錄因子大多與細(xì)胞增殖、分化、凋亡以及細(xì)胞耐藥等有關(guān)，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）[13]、NF-κB 抑 制 因 子 （NF-κB repressing factor，NRF）[14]、原癌基因 c-myc[15]、DNA 損傷結(jié)合蛋白 2（DNA damage-binding protein 2，DDB2）[16]、核糖體結(jié)合蛋白 1（Ribosome Binding Protein 1，RRBP1）[17]等。而已發(fā)現(xiàn)的IRES元件通常5’UTR偏長(zhǎng)、GC含量豐富、二級(jí)結(jié)構(gòu)復(fù)雜。FOSBmRNA 5’UTR符合上述IRES的基本特征，作者將FOSBmRNA 5’UTR的基因序列插入到研究IRES活性常用的雙熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒（pRL-FL）中，檢測(cè)其是否有IRES活性并初步探究其IRES的結(jié)構(gòu)與功能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在實(shí)驗(yàn)室初期構(gòu)建并保存真核表達(dá)載體即雙熒光素酶報(bào)告載體pRL-FL以及去啟動(dòng)子載體pRL-FL△SV40；大腸桿菌DH5a：天根生化科技有限公司；DNA限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和EcoRⅠ：Fermantas公司；T4 DNA連接酶和prime STAR HS DNA聚合酶：TaKaRa公司；重組質(zhì)粒pRL-FOSBFL：作者構(gòu)建；重組質(zhì)粒pRL-c-myc-FL：中美泰和購(gòu)買，DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清：美國(guó)Gibco公司；人胚腎細(xì)胞HEK293、人卵巢癌細(xì)胞A2780/WT、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8/WT、人肝癌細(xì)胞Bel-7402/WT及宮頸癌細(xì)胞Hela/WT：均保存于作者所在實(shí)驗(yàn)室的液氮罐中；紫杉醇，順鉑藥物：Sigma公司；LipofectamineTM 2000：美國(guó)Invitrogen公司；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（Dual?Luciferase Reporter Assay System）：美國(guó)Promega公司；其他試劑均為分析純?cè)噭?/p>

1.2 表達(dá)載體的構(gòu)建

FOSB 5’UTR cDNA 序列 （NM_001114171）由生工生物工程（上海）有限公司合成，合成序列含有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn)。FOSB5’UTR的全長(zhǎng)基因序列和實(shí)驗(yàn)所需的各截短基因序列均以重組質(zhì)粒pRL-FOSB-FL為模板進(jìn)行擴(kuò)增，在SV40啟動(dòng)子的載△pRL-FL上插入FOSB5’UTR的全長(zhǎng)基因序列，構(gòu)建△pRL-FOSB-FL；同時(shí)又載體pRL-FL上插入各截短片段，構(gòu)建出的截短片段的重組質(zhì)粒分別為 pRL-FOSB-J1-FL （-376 to-1）、pRL-FOSBJ2-FL（-592 to-217）、pRL-FOSB-J3-FL（-592 to-377）、pRL-FOSB-J4-FL （-188 to-1）、pRL-FOSBJ5-FL（-377 to-217）。將各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌Escherichia coliDH 5a中，涂板搖菌后，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，質(zhì)粒截短PCR所用引物見(jiàn)表1，其中下劃線是NdeI和EcoRI的酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 構(gòu)建截短質(zhì)粒PCR所用引物序列Table 1 Oligonucleotide primers used in PCR for deletion plasmids construct

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

人胚腎細(xì)胞HEK293、人卵巢癌細(xì)胞A2780/WT、人宮頸癌細(xì)胞Hela/WT培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基（加10%的血清），而肝癌細(xì)胞Bel-7402/WT和結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8/WT培養(yǎng)于RPMI 1640完全培養(yǎng)基（加10%的血清），待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，用胰酶消化傳代，待細(xì)胞再次長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，鋪細(xì)胞于24孔板，鋪板后第二天加入100 uL的opti-MEM，1 ug的質(zhì)粒以及 2 uL的 LipofectamineTM 2000混勻，孵育25 min，加入已換好液的24孔板中，培養(yǎng) 18～24 h后將細(xì)胞用 1×PLB（Passive Lysis Buffer）裂解，收于-80℃待用。

1.4 雙熒光素酶檢測(cè)活性

在24孔板中鋪細(xì)胞（70%～80%），細(xì)胞貼壁后（16～24 h）將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中，24 h后取出24孔板，用PBS洗兩遍，可輕微振蕩，并用槍頭將殘留PBS 吸干，加 100 uL 1×PLB（Passive Lysis Buffer）到每個(gè)孔中去裂解細(xì)胞，并在搖床上充分裂解15 min后，用槍頭吹打板底并收集細(xì)胞裂解液，將待檢樣置于-80℃中保存。對(duì)雙熒光素酶的活性檢測(cè)時(shí)，準(zhǔn)備干凈的Corning Costar 96孔白板，先加入20 uL的細(xì)胞裂解液，接著將加過(guò)裂解液的孔板放在GloMaxTM_96孔板發(fā)光檢測(cè)儀上，然后加入100 uL的螢火蟲(chóng)熒光素酶底物（LARⅡ），在充分混合后迅速地測(cè)定其熒光值，最后加入100 uL的反應(yīng)終止液海腎熒光素酶底物（Stop&Glo?reagent），使之充分混勻后，再測(cè)其熒光值。IRES的活性以螢火蟲(chóng)熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值表示（即Fluc/Rluc）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

本研究所有的數(shù)據(jù)均用GraphPad Prism 5.0軟件分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)采用SEM表示，組間比較采用Student t檢驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 *：P<0.05；**：P<0.005；***：P<0.000 5。

2 結(jié)果與分析

2.1 FOSB序列與結(jié)構(gòu)分析

在NCBI里搜索FOSB序列發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OSB序列較長(zhǎng)（592 bp）（見(jiàn)圖 1（a））且 GC 含量偏高（56.5%），在各種族間序列同源性較高達(dá)到55.74%（見(jiàn)圖1（b））。而用RNA Folding Form模擬其二級(jí)結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖 1（c）），可以看出 FOSB 5′UTR 可以形成穩(wěn)定且復(fù)雜的二級(jí)莖環(huán)結(jié)構(gòu)（ΔG=-202.87 kcal/mole），存在潛在的IRES元件。

2.2 FOSB mRNA 5’UTR IRES活性初步確定

FOSBmRNA 5’UTR是否含有 IRES活性，目前仍要借用工具質(zhì)粒，而檢測(cè)mRNA是否有IRES元件，國(guó)際上較為通用的是雙順?lè)醋訄?bào)告載體的方法，由帽依賴型機(jī)制來(lái)起始載體中的第一個(gè)順?lè)醋臃g，在載體上游順?lè)醋拥?’端和下游順?lè)醋拥?’端間插入有潛力的IRES元件，來(lái)介導(dǎo)下游順?lè)醋拥姆g[18]。而本研究中用到的雙熒光素酶報(bào)告載體，上游是螢火蟲(chóng)熒光素酶（FL），下游是海腎熒光素酶（RL）。如圖2（a）所示，在RL和FL之間有許多克隆位點(diǎn)，將基因目的片段克隆到I兩個(gè)酶切位點(diǎn)（NdeI和EcoR）之間，通過(guò)兩個(gè)熒光素酶活性比值的大小，來(lái)判斷目的基因是否具有IRES活性，如FL比RL的活性較高時(shí)，可初步認(rèn)為該目的基因有潛在的IRES元件。作者將FOSB5’UTR序列和陽(yáng)性對(duì)照c-myc 5’UTR序列分別插入到報(bào)告載體pRL-FL兩個(gè)閱讀框中間構(gòu)建目的載體pRLFOSB-FL、pRL-c-myc-FL（圖 2（b）），其中陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照分別是pRL-c-myc-FL與pRL-FL。然后將這三種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)人胚腎細(xì)胞HEK293中，收集細(xì)胞裂解液，24 h后，接著通過(guò)雙熒光素酶分析實(shí)驗(yàn)得到Fluc/Rluc的值。結(jié)果pRL-FOSB-FL活性遠(yuǎn)大于陰性質(zhì)粒（***，P<0.000 5），且與陽(yáng)性質(zhì)粒pRL-c-myc-FL活性相似，初步確定FOSBmRNA 5’UTR中存在假定的IRES元件。

雖然雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)已相對(duì)成熟，但如果插入的檢測(cè)序列中有內(nèi)部啟動(dòng)子，就會(huì)在細(xì)胞內(nèi)形成含有下游螢火蟲(chóng)熒光素酶的單順?lè)醋觤RNA的存在，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的判斷。為了排除這種潛在的可能性，于是將載體pRL-FL中的SV40啟動(dòng)子刪除，從而得到新的載體ΔpRL-FL（圖2（c）），接著仍將FOSBmRNA 5’ UTR 基因克隆到這個(gè)載體的兩個(gè)酶切位點(diǎn)（NdeI和EcoRI）之間，如FL有高表達(dá)，則目的基因中有隱含啟動(dòng)子，反之沒(méi)有內(nèi)部啟動(dòng)子。將FOSB克隆到載體△pRL-FL上得到△pRL-FOSB-FL，分別將pRL-FOSB-FL與△pRL-FOSB-FL瞬轉(zhuǎn)染入人胚腎細(xì)胞HEK293中，24 h后收集細(xì)胞并充分裂解，通過(guò)1.5實(shí)驗(yàn)步驟可得 Fluc/Rluc的值。如圖 2（d）所示，△pRL-FOSBFL的RL與FL值均遠(yuǎn)小于pRL-FOSB-FL的值（***，P<0.000 5），所以FOSB不含有內(nèi)部啟動(dòng)子，進(jìn)一步證明FOSBmRNA 5’UTR具有IRES活性。

圖1 FOSB mRNA 5’UTR序列與結(jié)構(gòu)分析Fig.1 Sequence and structure analysis of FOSB mRNA 5’UTR

2.3 FOSB mRNA 5’UTR IRES活性中心的鑒定

對(duì)FOSB 5’UTR IRES元件活性中心域的的探究，通過(guò)RNA Folding Form軟件來(lái)模擬FOSBmRNA 5’UTR全長(zhǎng)序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)，并對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，分別構(gòu)建了5個(gè)截短質(zhì)粒：pRLFOSB-J1-FL（-376 to-1）、pRL-FOSB-J2-FL（-592 to-217）、pRL-FOSB-J3-FL （-592 to-377）、pRLFOSB-J4-FL（-188 to-1）、pRL-FOSB-J5-FL（-377 to-217）。將pRL-FOSB-FL以及各截短質(zhì)粒瞬轉(zhuǎn)染入人胚腎細(xì)胞HEK293與肝癌細(xì)胞Bel-7402中，24 h后收集細(xì)胞裂解液用于測(cè)定Fluc/Rluc（見(jiàn)圖3（a）），兩種細(xì)胞的測(cè)活結(jié)果基本一致。首先從5’端開(kāi)始截短，發(fā)現(xiàn)-376至-1活性僅降為全長(zhǎng)活性的75%左右，說(shuō)明5’端可能對(duì)其活性貢獻(xiàn)較大；繼續(xù)截短發(fā)現(xiàn)在-188至-1活性降為全長(zhǎng)的21%～30%，猜測(cè)可能中間片段對(duì)其IRES活性貢獻(xiàn)更大；為了驗(yàn)證其3’端的重要性，對(duì)3’端進(jìn)行截短，發(fā)現(xiàn)-592至-377活性下降了75%左右，證明3’端對(duì)其IRES活性確實(shí)重要，但是截到-217（即-592至-217）時(shí)活性又增加到全長(zhǎng)的60%左右，懷疑其活性中心序列可能是位于中間的-376至-217，并將該片段插入到雙順?lè)醋虞d體pRL-FL中。如圖3（b）所示，截短質(zhì)粒-376至-217與全長(zhǎng)活性相比，展現(xiàn)出為全長(zhǎng)活性的70%～85%，從而判斷確定其IRES活性中心為-376至-217，即-376至-217對(duì)最高活性的貢獻(xiàn)較大。結(jié)果顯示FOSB mRNA 5’端非翻譯區(qū)-376至-217序列可能是其IRES活性重要活性區(qū)域，而其兩端序列可能抑制其IRES的活性。

圖2 FOSB mRNA 5'UTR IRES活性初步確定Fig.2 Activity of FOSB mRNA 5'UTR IRES preliminary determined

2.4 FOSB mRNA 5’UTR在各細(xì)胞中的IRES活性

從上述實(shí)驗(yàn)不難發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OSBmRNA 5’UTR在HEK293細(xì)胞與Bel-7402/WT細(xì)胞中IRES活性不同，其中在肝癌細(xì)胞Bel-7402/WT中活性較高。為了繼續(xù)探究其IRES活性在癌細(xì)胞中是否是異常表達(dá)，作者將重組質(zhì)粒pRL-FOSB-FL轉(zhuǎn)染進(jìn)另外3株癌細(xì)胞包括人卵巢癌細(xì)胞A2780/WT、人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-8/WT、人宮頸癌細(xì)胞Hela[19]。24 h后收集細(xì)胞裂解液，測(cè)定螢火蟲(chóng)熒光素酶和海腎熒光素酶的活性并計(jì)算其比值（Fluc/Rluc）。如圖4所示，在不同細(xì)胞中FOSBmRNA 5’UTR IRES活性有著明顯的區(qū)別，其中與HEK293細(xì)胞相比，A2780/WT中的活性較高（***，p<0.000 5），Hela 與 Bel-7402/WT細(xì)胞的活性也高于 HEK293 細(xì)胞（*，p<0.05；**，p<0.005）。而大多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道[20]，IRES的活性與細(xì)胞中 IRES 結(jié)合蛋白（IRES trans-acting factors，ITAFs）的表達(dá)量有密切關(guān)系，可能在這些癌細(xì)胞中，其ITAFs表達(dá)量較高，這需要進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

圖3 重組質(zhì)粒pRL-FOSB-FL及其截短轉(zhuǎn)染細(xì)胞的IRES的相對(duì)活性Fig.3 Relative IRES activities of cells transfected with recombinant plasmids pRL-FOSB-FL and its deletions

2.5 FOSB mRNA 5’UTR在細(xì)胞壓力下的IRES活性

將重組質(zhì)粒pRL-FOSB-FL轉(zhuǎn)染進(jìn)肝癌細(xì)胞Bel-7402/WT中24 h以后，分別用藥物紫杉醇（PTX）和順鉑（DDP）處理細(xì)胞，PTX 的使用質(zhì)量濃度分別為 0、0.25、0.5 ug/mL，DDP 的使用質(zhì)量濃度為 0、0.5、1 ug/ml），加藥培養(yǎng) 18 h，在兩種藥物中，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，其IRES活性均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，見(jiàn)圖5。說(shuō)明IRES作為一種應(yīng)激翻譯起始機(jī)制，在藥物刺激下FOSBIRES活性會(huì)增加，另外在紫杉醇刺激下比順鉑更為明顯 （*，p<0.05；**，p<0.005），可能與藥物不同的作用機(jī)制相關(guān)。

圖4 重組質(zhì)粒pRL-FOSB-FL轉(zhuǎn)染各個(gè)細(xì)胞的熒光素酶的相對(duì)活性Fig.4 Rletive luciferase activity of pRL-FOSB-FL in various cell lines.（*，p ＜0.05；**，p ＜0.005；***，p ＜0.000 5；student t test）.The expression data are presented asthemean + SEM oftriplicate samples

圖5 細(xì)胞壓力條件對(duì)Bel-7402細(xì)胞中FOSB IRES活性的影響Fig.5 FOSB IRES activity in Bel-7402 cells during different cell stress （*，p＜0.05；**，p＜0.005；***，p＜0.000 5；student t test）.The expression data are presented asthemean + SEM oftriplicate samples

3 結(jié)語(yǔ)

在真核生物內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定狀態(tài)下大多以帽依賴型機(jī)制進(jìn)行翻譯，而真核細(xì)胞處于細(xì)胞壓力條件（低氧、饑餓、藥物刺激），此時(shí)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及凋亡會(huì)使細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)迅速打亂。這時(shí)帽依賴的翻譯效率會(huì)降低，而此時(shí)IRES介導(dǎo)的翻譯卻會(huì)增加，進(jìn)而使細(xì)胞繼續(xù)維持穩(wěn)態(tài)環(huán)境。FOSB作為立早基因中的一員，在多種刺激后會(huì)立即表達(dá)，從而產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄因子，進(jìn)而調(diào)控其他基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)來(lái)維持細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育和分化[21]。最新的報(bào)道顯示，F(xiàn)OSB基因在抗癌藥物的刺激下在細(xì)胞增殖速率增加[22]，故作者在研究FOSBmRNA 5'UTR活性的同時(shí)，對(duì)其進(jìn)行加藥刺激，發(fā)現(xiàn)其不僅具有IRES活性，并且其在抗癌藥物（紫杉醇和順鉑）刺激下IRES活性增加，這或許與IRES是一種應(yīng)激翻譯機(jī)制，能夠維持IRES在細(xì)胞壓力條件下的基本表達(dá)密切相關(guān)。另外FOSB/ΔFOSB作為慢性成癮的關(guān)鍵分子轉(zhuǎn)換機(jī)制，在成癮藥物慢性刺激后出現(xiàn)累積現(xiàn)象，并表現(xiàn)出獨(dú)特的高度穩(wěn)定性[23]，這暗示著FOSBmRNA 5'UTR的IRES活性可能與其在藥物刺激下的穩(wěn)定表達(dá)有關(guān)。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，具有IRES活性的RNA有以下特征：1）富含 GC 堿基；2）較長(zhǎng)的 5'UTR；3）二級(jí)結(jié)構(gòu)較復(fù)雜。決定IRES功能的因素是IRES元件的序列結(jié)構(gòu)以及其反式作用因子（ITAFs），故IRES元件研究的熱門總是去尋找其序列結(jié)構(gòu)抑或者機(jī)制上的共性。而作者通過(guò)截短分析發(fā)現(xiàn)了FOSBmRNA 5'UTR IRES活性中心位于其5'UTR的-376至-217之間，并通過(guò)將該片段連接到雙順?lè)醋虞d體再次驗(yàn)證-376至-217的IRES活性。相較于國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的細(xì)胞內(nèi)的IRES元件，F(xiàn)OSBIRES元件在序列與結(jié)構(gòu)上相似度均不高，但是通過(guò)在NCBI里面進(jìn)行序列搜索，并在DNAMAN中對(duì)其物種間同源性進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)種族間相似性達(dá)55%以上，其同源性位置包括其活性中心，IRES的活性序列位于FOS基因種族保守序列中，這間接說(shuō)明了FOSBIRES序列的保守性，暗示IRES元件在Fos家族中具有相對(duì)穩(wěn)定性。

FOSB/Delta FOSB與藥物成癮的機(jī)制研究較多，而其與腫瘤形成的機(jī)制鮮少提到，其實(shí)FOSB與乳腺癌和卵巢癌的形成密切相關(guān)，而目前的研究顯示，在FOSB基因在乳腺癌、卵巢癌、胃癌及肺癌等多種癌細(xì)胞中發(fā)揮重要的作用，這或使FOSB基因成為某些腫瘤的診斷標(biāo)志物，用于腫瘤的預(yù)防。而本研究中選用不同的癌細(xì)胞測(cè)其IRES活性，發(fā)現(xiàn)FOSBIRES活性在不同的癌細(xì)胞中明顯不同，在卵巢癌細(xì)胞中活性較高，這為其成為腫瘤診斷標(biāo)志物提供了另一種思路。