強化交聯促進透明質酸凝膠的抗酶解能力

陸柳伸，鄭夢玲，郝夢瑤，王 武，辛 瑜

（江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122）

透明質酸（hyaluronic acid，HA）又稱玻璃酸、玻尿酸，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺以β-1，4和β-1，3糖苷鍵交替連接而成的線性高分子粘多糖[1]，通常以鈉鹽形式廣泛存在于動物組織的細胞外基質中，如皮膚、眼睛玻璃體、滑液和血液等[2]。其相對分子量一般在104～107之間。1934年Meyer和 Palmer[3]最先在從牛眼玻璃體中分離得到HA，由于HA特殊的理化性質[4-5]，廣泛應用于臨床、診斷、食品和化妝品行業中[6-9]。目前，HA主要利用微生物發酵法進行大規模生產[10-11]。

HA是細胞外基質和細胞間質的主要成分，在維持細胞和組織的結構完整以及細胞內外的環境平衡中起到重要作用，并且對細胞的生理功能有重大影響。HA在水溶液中與水分子結合形成氫鍵，因此具有良好的保水性，經研究發現[12]，HA分子可以保留其自身質量的500～1 000倍的水，被譽為“天然保濕因子”。HA在水溶液中呈網狀結構，使其擁有特殊的流變學性質即粘彈性。HA具有保濕護膚、抗衰老的功能，還有營養皮膚、潤滑性和增稠等作用，因此，富含透明質酸的化妝品目前在國際上被譽為“仿生化妝品”。注射用透明質酸凝膠已經廣泛用于整形行業，如Restylane、YVOIRE、潤百顏、海薇等國內外品牌。

人體中HA含量減少會使皮膚變得粗糙并產生皺紋，會導致關節炎、動脈硬化和腦萎縮等疾病，也會產生早老癥[13-18]。為了補充人體內HA含量，可以通過口服透明質酸來補充，其效果明顯，已在歐美、日本等發達國家應用于保健食品中。美國透明質酸保健食品在近幾年有許多品牌上市，如Natural Max公司生產的Beauty Fast膠囊，Source Naturals公司生產的含HA的膠丸和片劑等。我國臺灣和大陸也有產品陸續上市，如口服美容膠原透明質酸、瑞爾水緣膠囊等。

由于透明質酸凝膠在人體內會被自身透明質酸酶降解，從而限制了其應用[19-21]。為了增強凝膠的機械強度以及在人體內的滯留時間，目前常用BDDE以及DVS等交聯劑進行交聯[22-24]。為了進一步強化透明質酸凝膠的穩定性，作者擬采用初次交聯-強化交聯偶聯的制備模式，見圖1。在透明質酸凝膠成型后進一步加固凝膠顆粒的結構，以此來提高透明質酸凝膠的抗酶解能力。

圖1 初次交聯-強化交聯偶聯的模式Fig.1 Schematic of the primary and enhanced crosslinking of HA

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

透明質酸（相對分子質量1.7×106）：購自華熙福瑞達生物醫藥有限公司；潤百顏、艾麗薇、海薇、瑞蘭：福瑞達生物醫藥有限公司；1，4-丁二醇縮水甘油醚（BDDE）、透明質酸酶、小鼠胚胎成纖維細胞和葡萄糖醛酸：Sigma公司；遺傳毒性Ames試劑盒：匯智泰康生物技術有限公司；無水乙醇、硫酸、氯化鈉、氫氧化鈉和硼砂等：由江南大學試劑科提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 透明質酸凝膠的制備及初次交聯條件的篩選HA交聯采用的工藝流程見圖2。HA交聯反應與NaOH的濃度、反應溫度、反應時間及HA與BDDE的摩爾比有關。通過設計一個四因素四水平的正交試驗來確定最佳交聯條件，其因素水平表見表1。

圖2 HA交聯的工藝流程Fig.2 Process of crosslinking of HA

表1 HA初次交聯的因素水平表Table 1 Factor level table for primary crosslinking of HA

1.2.2 透明質酸鈉含量的測定透明質酸鈉（SH）是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖組成的非均一的物質，其中含有多種不同相對分子質量的透明質酸鈉分子，因此不能用均一物質的測定方法來測量透明質酸鈉質量濃度。采用改良的咔唑法[25-26]來測定透明質酸鈉的質量濃度，透明質酸鈉分子在酸性條件下被水解成 D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖，其中D-葡萄糖醛酸能與咔唑發生顯色反應，在530 nm波長處有最大吸收，且吸光值與D-葡萄糖醛酸質量濃度成正比，以吸光值（A）對葡萄糖醛酸質量濃度（C）做線性回歸方程，得到回歸方程：A＝0.015 3C－0.007 2，R2＝0.998 6。 表明葡萄糖醛酸質量濃度在0～50 μg/mL范圍內，A與C呈良好的線性關系。此方法通過回歸方程來確定葡萄糖醛酸質量濃度，進而計算出透明質酸鈉的質量濃度。

式中，Ci為葡萄糖醛酸的質量濃度（μg/mL）；401.3為透明質酸鈉單體相對分子質量；194.1為葡萄糖醛酸相對分子質量；200為稀釋倍數。

1.2.3 透明質酸凝膠強化交聯為了提高交聯透明質酸凝膠的理化性質，將初次交聯所得的凝膠進行強化交聯，并通過NaOH的濃度、反應溫度、反應時間及HA與BDDE的摩爾比這4個因素來設計一個四因素四水平的正交試驗，見表2，以此確定強化交聯的最佳條件。

表2 HA強化交聯的因素水平表Table 2 Factor level table for enhanced-crosslinking of HA

1.2.4 透明質酸凝膠的降解率取0.5 g HA凝膠，加300 U/mL的透明質酸酶溶液2 mL，37℃下反應24、48、72 h，取 0.2 mL 加無水乙醇 4.8 mL，用濾器過濾得到1 mL溶液，加PBS至8 mL，作為甲液。另取HA凝膠0.5 g，加0.5 mol/L的硫酸溶液10 mL，沸水浴水解15 min，定容至100 mL，作為乙液[27]。分別取甲液和乙液各1 mL，用改良的咔唑法測定溶液中糖醛酸的質量濃度。

1.2.5 透明質酸凝膠交聯度的測定將最佳交聯條件得到的凝膠用酸水解后，所得的甘油的量用氣相色譜法檢測[28]，以此來確定交聯度。

樣品處理：取凝膠2.5 g，加2.5 mol/L HBr 5 mL，沸水浴水解50 min，用NaOH調節pH至中性，冷凍干燥，加4 mL無水乙醇過濾，濾液用于氣相色譜測定。

色譜條件：色譜柱：HP-INNOWAX（30 mm×0.25 mm×0.25 mm）；柱溫：100℃；20℃/min程序升溫至230 ℃，并保持 0.5 min；柱流速：8.0 mL/min；分流比：1∶1；進樣量：1 μL；進樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：270℃；載氣：氮氣；檢測器：氫火焰離子化檢測器。

1.2.6 透明質酸凝膠的紅外光譜將初次交聯得到的凝膠和強化交聯得到的凝膠冷凍干燥，做FTIR，與未交聯的透明質酸作對比。

1.2.7 透明質酸凝膠的細胞毒性根據GB/T16886國家標準[29]，透明質酸凝膠需進行體外細胞毒性測試。其中浸提條件：浸提介質為10%血清細胞培養液，浸提比例為每0.2克樣品加1 mL浸提介質，浸提溫度為37℃，浸提時間為24 h。采用小鼠胚胎成纖維細胞，用細胞培養液配制成1×104個/mL的細胞懸液，在96孔板中加入100 μL的細胞懸浮液。在37℃、5%的CO2培養箱中培養48 h，棄去原培養液，每孔加入200 μL的空白對照液以及透明質酸凝膠，每組設立8個孔。并在37℃、5%的CO2培養箱中培養48 h。接著加入20 μL噻唑藍（MTT，質量濃度為5 mg/mL），置含 5% 二氧化碳培養箱，在（37±2）℃下培養 5 h，棄去孔內液體，并加入200 μL DMSO，用酶標儀在570 nm和630 nm處測吸光值，其結果根據細胞的相對增生率（RGR）來判斷，見表3。其中2級毒性以內的測試材料生物安全性均符合要求。

表3 細胞相對增生率與細胞毒性的分級關系Table 3 Relationship between cell relative proliferation rate and cytotoxicity grade

1.2.8 透明質酸凝膠的Ames試驗根據GB15193.4的要求[30]，采用平板滲入法在加與不加S9混合液的條件下對TA97、TA98、TA101和TA102共4株菌株進行Ames試驗，并統計回變菌落數。受試物透明質酸凝膠設立 4 個劑量：5、50、500、5 000 μg/皿，同時設立空白對照 （自發回變）、溶劑對照（200 μL/皿的無菌水）以及陽性對照（2-氨基芴、甲基磺酸甲酯、敵克松、1，8-二羥基蒽醌）。其中每個劑量組做3個培養皿，并在相同條件下重復2次試驗。其結果根據回變率（MR，受試物回變菌落數/自發回變菌落數）來判斷，若MR≥2，則結果判斷為陽性結果，若MR＜2，則結果判定為陰性結果。

1.2.9 透明質酸凝膠的溶血實驗乙醚麻醉兔后，自心臟抽取血液40 mL，加入4 mL肝素抗凝，用生理鹽水洗滌，離心至上清液不顯紅色，取2 mL上清液加入到100 mL生理鹽水中，即得2%的兔紅細胞混懸液[31]。各取凝膠1 mL，加生理鹽水至2.5 mL，在37℃恒溫水浴30 min，加2%的兔紅細胞混懸液2.5 mL，在576 nm處測其吸光值，并設立陽性對照組（蒸餾水）和陰性對照組（生理鹽水），溶血度計算如下：

一般認為生物材料的溶血度小于5%，都是可以接受的。

2 結果與分析

2.1 透明質酸凝膠初次交聯條件的篩選

HA的交聯條件根據降解率（R，%）的大小以及透明質酸鈉的質量濃度來選擇。降解率越小，說明凝膠的抗酶解能力越高，結果見表4。可以看出，第9組實驗得到的降解率在前3天都是最小的。通過極差分析可知，對交聯反應的影響程度大小依次是NaOH的濃度、BDDE/HA、反應時間、反應溫度。即NaOH的濃度影響最大，溫度的影響最小。得到初次交聯的最佳條件為：反應溫度是50℃，NaOH的濃度是 0.1 mol/L，反應時間是 4.5 h，BDDE/HA 是 1∶2。采用此條件得到的凝膠有最好的抗酶解能力。此凝膠連續3 d的降解率分別為9.76%、16.79%、20.45%，透明質酸鈉質量濃度為28.84 mg/mL，接近市場現有水平，見表5。所以選擇此凝膠強化交聯。

表4 HA初次交聯Table 4 Primary crosslinking of HA

續表4

表5 市場上透明質酸凝膠產品中透明質酸鈉的質量濃度及降解率Table 5 Content of HA and the degradation rate of HA with the products on the market

2.2 透明質酸鈉質量濃度的測定

透明質酸鈉的質量濃度可以通過測定葡萄糖醛酸的質量濃度來計算得到，目前市場上透明質酸凝膠產品中透明質酸鈉的質量濃度見表5。篩選出抗酶解能力強并且透明質酸鈉質量濃度接近目前市場現有產品的凝膠及交聯條件。

2.3 透明質酸凝膠強化交聯條件的篩選

以反應溫度是50℃，CNaOH的濃度是0.1 mol/L，反應時間是 4.5 h，BDDE/HA 是 1∶2 為條件，將得到的透明質酸凝膠進行強化交聯，所得的結果如表6所示。由表6可知，強化交聯對初次交聯的影響有增強作用也有減弱作用。其中第1組實驗得到的降解率最小。通過極差分析可知，對交聯反應的影響程度大小依次是反應時間、BDDE/HA、NaOH的濃度、反應溫度。即反應時間影響最大，溫度的影響最小。采用反應溫度是35℃，CNaOH的濃度是0.05 mol/L，反應時間是 1.5 h，BDDE/HA 是 1∶8 的條件將得到。此凝膠連續三天的降解率分別為6.85%、7.56%、12.4%，透明質酸鈉含量為29.03 mg/mL。

表6 HA強化交聯Table 6 Enhanced-crosslinking of HA

續表6

2.4 透明質酸凝膠的交聯度

所得的氣相色譜圖見圖3。通過計算得到2.5 g凝膠酸解得到甘油的摩爾數分別是4.91×10-5mol和 8.53×10-5mol，HA雙糖與甘油的摩爾比約為4.2：1，假設HA的羥基與BDDE中所有的醚鍵均開環反應，得到初次交聯得到的凝膠的交聯度為16.54%，強化交聯得到的凝膠的交聯度為54.52%。

圖3 將透明質酸凝膠完全酸解后，通過氣相色譜測定甘油的質量分數（6.0 min）Fig.3 Determination of cross-link degree After an acidic hydrolyzation，the glycerol content was determined by GC chromatography，and the glycerol peak was at 6.0 min

2.5 透明質酸凝膠的紅外光譜分析

初次交聯得到的凝膠、強化交聯得到的凝膠以及未交聯的透明質酸的FT-IR圖譜見圖4。從圖4可以看出，在3 420-1cm附近有羥基O-H或N-H吸收峰，在1 660-1cm附近有C=O吸收峰，在1 400-1cm附近有C-N吸收峰，在1 050-1cm附近有C-O-C吸收峰。說明初次交聯、強化交聯后得到的凝膠的特征吸收峰與未交聯的透明質酸的特征吸收峰基本一致，符合規定。

圖4 紅外光譜分析Fig.4 FT-IR spectra of different HA gels

2.6 透明質酸凝膠的細胞毒性

通過計算得到透明質酸凝膠的細胞相對增生率（RGR）以及毒性級別見表7。其中初次交聯所得的凝膠在570 nm和630 nm處的RGR分別為88.9%和85.6%，均大于80%，為一級毒性，強化交聯所得的凝膠的RGR在570 nm和630 nm處分別為85.5%和80.9%，均大于80%，為一級毒性，都符合要求。

表7 透明質酸凝膠的細胞毒性分級Table 7 Cytotoxicity grade for HA gels

2.7 透明質酸凝膠的遺傳毒性

其遺傳毒性結果見表8。可知，初次交聯和強化交聯所得的凝膠在加與不加S9混合物的條件下，其回變率（MR值）均小于2，判定為陰性結果，沒有明顯的致突變性。

表8 透明質酸凝膠的Ames試驗（x±s，n=3）Table 8 Ames test of HA gels（x±s，n=3）

2.8 透明質酸凝膠的溶血性

初次交聯和強化交聯所得的凝膠的溶血度見表9。其中溶血度分別為2.67%和2.60%，均小于5%，認為具有良好的生物相容性，沒有明顯的溶血性，符合一般生物材料溶血度的要求。

表9 透明質酸凝膠的溶血度Table 9 Hemolysis for HA gels

3 結語

通過初次交聯-強化交聯的偶聯模式來制備透明質酸凝膠，得到初次交聯凝膠和強化交聯凝膠。設計四因素四水平的正交試驗來確定初次交聯的最佳條件：反應溫度50℃，氫氧化鈉濃度為0.1 mol/L，反應時間4.5 h，透明質酸與交聯劑的摩爾比為2∶1；強化交聯的最佳條件：反應溫度35℃，氫氧化鈉濃度為0.05 mol/L，反應時間1.5 h，透明質酸與交聯劑的摩爾比為8∶1。并測得凝膠的透明質酸鈉質量濃度從初次交聯的28.84 mg/mL上升到強化交聯的29.03 mg/mL，沒有較大的變化。分別用透明質酸酶降解凝膠，發現強化交聯的凝膠的降解率下降了30%左右，交聯度提高了3倍多。其中初次交聯凝膠的抗透明質酸酶降解效率接近市場現有水平，強化交聯凝膠的抗透明質酸酶降解效率在原有水平有較大提升。通過FT-IR分析發現，凝膠的結構與HA相比基本沒有變化，并且在細胞毒性、遺傳毒性、溶血試驗中，結果均符合要求。因此，本方法可以得到抗酶解能力強的凝膠，并且可以提高交聯度。但是，透明質酸凝膠在人體內的滯留時間需要進一步通過實驗證明。