水貂眼炎雙球菌病的病原分離鑒定及治療

禚寶山 李富金 李金波 秦緒偉 趙遠

水貂眼炎雙球菌病的病原分離鑒定及治療

禚寶山 李富金 李金波 秦緒偉 趙遠

（齊魯動物保健品有限公司 山東 濟南 250100）

本研究對山東發病貂的眼炎進行了病原篩選，棉拭子沾取眼結膜分泌物進行了犬瘟熱、支原體PCR檢測，結果顯示：犬瘟熱陰性，支原體陽性；眼結膜棉式子細菌培養，不同場水貂均分離到相同細菌，經純化培養、染色鏡檢、生化試驗、溶血試驗和PCR檢測等試驗，鑒定為雙球菌。對分離到的雙球菌及棉式子浸出過濾液進行動物回歸試驗，結果顯示：單點雙球菌及支原體濾液與雙球菌混合液可復制出水貂眼炎，而單點支原體濾液不能復制水貂眼炎。分離菌對頭孢氨芐、復方阿莫西林、新霉素、丁胺卡那霉素高度敏感，敏感藥治療眼炎有效。

水貂眼炎 雙球菌病原 分離鑒定

雙球菌是鏈球菌科雙球菌屬的細菌，該菌廣泛分布于自然界中，常在于健康人、動物的體表、黏膜上寄生，主要引起肺炎、支氣管炎、腦膜炎、尿道炎、中耳炎、敗血癥等疾病。資料顯示，雙球菌有廣泛的宿主，可以感染人與豬、羊、兔、水貂、狐貍、貉、犬、大熊貓等多種動物。本菌感染動物不同器官而引起不同病癥，其發病率、死亡率也因菌株本身致病性、感染動物的易感性及感染器官不同而差異懸殊。目前，國內對動物雙球菌報道不多，且多集中在肺炎雙球菌，幾乎沒有眼炎雙球菌的報道。

近幾年，水貂秋季流淚濕眼圈臨床病例增多，以白貂多發，其他品種貂也有發生，輕重不一，有人懷疑是慢性犬瘟熱，有人懷疑是飼料、營養、環境等非傳染性因素引起，也有人認為是其他致病菌引起，眾說紛紜，因很少引起死亡，且能自愈，因此關注的人不多，沒有文獻可查。2018年10月，筆者對山東臨沂、青島地區的兩個發生眼炎的水貂場進行了臨床調查、病原分離鑒定、動物回歸等實驗室檢測。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 將發病水貂保定后，用滅菌棉拭子沾取眼結膜、角膜的分泌物，每個場采集6只水貂分泌物棉式子。

1.1.2 培養基 血清營養瓊脂培養基、麥康凱培養基、鮮血瓊脂培養基及SS培養基，均由齊魯動物保健品有限公司生藥研究所(山東省獸用生物制品工程實驗室)提供

1.1.3 試驗動物 健康青年水貂8只，購自章丘某水貂場。

1.1.4 藥敏片 氨芐青霉素、安普霉素、新霉素、丁胺卡那霉素、慶大霉素、環丙沙星、恩諾沙星、氟哌酸、林可霉素、大觀霉素、磷霉素購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.1.5 引物 犬瘟熱、細菌16S及支原體引物均由齊魯動物保健品有限公司生藥研究所(山東省獸用生物制品工程實驗室)提供。

1.1.6 儀器設備及其他實驗用品 PCR儀A300型號，購自杭州朗基科學儀器有限公司；電熱恒溫培養箱DNP-9162型號，購自上海精宏實驗設備有限公司；顯微鏡CX-31，購自日本奧林巴斯；0.22um針頭濾器，購自Merck Millipore；染色液、離心管等實驗室常用材料及設備均由齊魯動物保健品有限公司生藥研究所(山東省獸用生物制品工程實驗室)提供。

1.2 方法

1.2.1 現場調查 走訪臨沂沂南、青島膠南兩個水貂場，現場調查養殖環境、發病時間、臨床癥狀、發病率、病死率等。

1.2.2 細菌分離純化 把沾取了眼分泌液的棉式子，依次劃線接種血清瓊脂培養基、麥康凱培養基及SS培養基，37℃恒溫箱過夜。對分離到的細菌，挑取典型菌落，分區劃線接種血清瓊脂培養基進行再次純化培養。

1.2.3 PCR檢測 將棉式子集中，加生理鹽水5ml，離心，取上清液，按照常規方法提取

1.2.4 染色鏡檢 挑取典型分離菌落涂片，革蘭氏染色，油鏡觀察。

1.2.5 生化試驗 采取常規生理生化試驗方法[1]，將純化后細菌接種到乳糖、麥芽糖、葡萄糖、菊糖、棉實糖及海藻糖等多種糖、甘露醇、梨醇、觸媒、膽鹽等微量發酵管中，置37℃恒溫培養箱，培養24~48h，觀察記錄結果。

1.2.6 溶血試驗 將純化后的細菌，挑取典型菌落，劃線接種于綿羊鮮血瓊脂培養基，置37℃恒溫培養箱，培養18~24h，觀察記錄結果。

1.2.7 藥敏試驗 采用藥敏紙片瓊脂擴散法，將分離純化的細菌劃線在血清瓊脂培養基上，再將藥敏片貼在培養基上，置37℃恒溫培養箱，培養18~24h，觀察記錄結果。

1.2.8 動物回歸試驗 將8只健康青年水貂隨機分為4組，其中3組為試驗組，另1組為對照。試驗1組，水貂2只，用雙球菌培養液點眼；試驗2組，水貂2只，用棉式子支原體液點眼；試驗3組，水貂2只，用雙球菌與棉式子支原體濾液混合后點眼；對照組，用生理鹽水點眼。點眼后觀察試驗貂眼睛是否有紅腫、流淚現象，連續觀察5d，如果復制出病癥，則觀察7d以上觀察炎癥發展情況。

2 結果

2.1 現場調查結果

臨沂的水貂場是一個擁有10000種貂的規模場，場內設施設備齊全，場主從事水貂養殖多年，有豐富養殖經驗，第一次遇到這種病癥；青島的水貂場規模1000種貂，場主有30多年的養殖經驗，設施設備簡陋，但干凈衛生，兩個場發病時間均在9月20號左右，并且周圍貂場也有不少出現這種病癥。臨床癥狀相似，表現為貂群中公貂突然有因流眼淚而濕眼圈的，傳播快，開始主要是流眼淚，有單眼流淚的，多數兩個眼都流淚，7~8d左右達到發病高峰，持續約20多天，發病率5%~30%，幾乎沒有死亡，極個別因感染其他疫病死亡，有人懷疑是非典型性犬瘟熱，做了犬瘟熱疫苗免疫，有人認為濕眼圈病是季節病，不用治療，立冬后自愈。做犬瘟熱疫苗的效果不明顯，仍然有水貂陸續出現，沒有并發感染則很少有死亡。投喂抗生素能減輕癥狀。

2.2 細菌分離純化

兩個不同地區不同養殖場采集的棉式子，分離到相同的菌，分離菌在血清瓊脂培養基上生長良好，形成細小、圓形、光滑、扁平菌落，麥康凱平板、SS瓊脂平板均不生長。

2.3 PCR擴增

犬瘟熱陰性，雙球菌及支原體陽性。

2.4 染色鏡檢

視野中可見有革蘭氏陽性球菌，菌體呈現卵圓形，多數成雙排列，為雙球狀。

2.5 生化試驗

分離菌可分解乳糖、麥芽糖、葡萄糖、菊糖、棉實糖及海藻糖，不分解甘露醇和梨醇，觸媒試驗陰性，膽鹽溶解陽性。

圖1 PCR檢測電泳圖譜

(注：M：DL2000 Marker；1：CDV陽性對照；2：CDV陰性對照；3：樣品CDV樣品檢測；4：樣品雙球菌檢測；5：雙球菌陰性對照；6：支原體陽性對照；7：支原體陰性對照；8：樣品支原體檢測)

圖2 細菌鏡檢結果

2.6 溶血試驗

在鮮血瓊脂培養基上生長良好，形成細小、透明菌落，有明顯的溶血環。

2.7 藥敏試驗

分離菌對頭孢氨芐、復方阿莫西林、新霉素、丁胺卡那霉素高度敏感，環丙沙星、恩諾沙星中敏，慶大霉素、氟哌酸、林可霉素、大觀霉素、磷霉素不敏感。

2.8 動物回歸試驗

試驗1、3組水貂點眼后第2天均出現了羞明流淚臨床癥狀，試驗2組及對照組水貂正常。

2.9 病貂治療

選擇敏感藥頭孢氨芐溶液點眼，3d后發病水貂眼炎恢復。

3 討論與小結

（1）引起水貂眼炎的因素很多，如維生素A缺乏、嚴重脂肪肝或者黃脂肪病等其他肝病發生，環境中有氨氣、刺激性消毒劑等化學物質刺激均能引起非傳染性眼炎，若群中發病個體多，常誤以為是傳染病，條件改善，疫病很快消除，有別于傳染性因素，本文案例通過調查養殖場環境、飼養管理等，排除了非傳染因素。（2）眼睛感染支原體或綠膿桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌、雙球菌等細菌會引起具有傳染性的眼炎，犬瘟熱等全身性疾患也有眼炎癥狀，為了篩查本案例的真正病原，實驗室做了犬瘟熱、支原體PCR檢測，進行了細菌分離，從結果上看，排除了犬瘟熱，分離到細菌，支原體PCR陽性，懷疑是可能與這兩種或者其中一種病原有關。（3）分離菌經染色鏡檢，純化培養、生化試驗、溶血試驗、PCR檢測，確定為致病性雙球菌。（4）動物回歸試驗結果顯示，雙球菌是本案例的致病原，單純支原體并不能復制出臨床癥狀，排除了支原體單獨或者聯合致病的可能。（5）每年秋季，部分貂場的水貂出現流眼淚、濕眼圈及流眼眵等病癥，一段時間后該病癥可以自愈，因為很少引起死亡，所以很少有人研究其病因，本研究從眼炎病例分離到雙球菌，并復制出病癥，確診為眼炎雙球菌，證實了雙球菌是秋季水貂濕眼圈病的病因之一。（6）該病很少引起死亡，但是有一定傳染性，環境中病菌一旦感染其他器官，可能會引起其他損失，不得不防。（7）通過藥敏試驗發現，分離菌株耐藥性并不強，敏感藥物比較多，氨芐青霉素溶液點眼，效果顯著，但應該注意，直接點眼治療，選擇的藥物需要稀釋后不能傷害眼及眼結膜。

[1] 陸承平. 獸醫微生物學(第5版)[M]. 北京: 中國農業出版社, 2013: 83-90.

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（2019–09–02）

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