高乳酸乙酯酯化液的制備及其在調味酒生產中的應用

魏志陽，任 雪，韓 經，張華東，郭學武，肖冬光

（天津科技大學 生物工程學院 工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津 300457）

白酒的主要風味成分可分為酸類、酯類、醇類、醛類及其他五大類，其中酯類物質所占比例最大，而“四大酯”（乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯）約占白酒中總酯含量的90%以上[1]。其中，乳酸乙酯香弱、稍甜，含量較高時帶澀味，是白酒的重要呈香物質[2]，其含量高低直接影響酒的品質與風格特點[3]。通常認為，白酒中乳酸乙酯是由乳酸菌等產酸微生物代謝產生的乳酸與酒精在酯化酶的作用下形成[4]，且以胞外酶的酯化合成為主，但也不排除胞內酶的補償作用，如霉菌、某些酵母菌和細菌分泌的胞外酯化酶等[5-7]。

傳統固態法的白酒釀造過程中，其開放式的發酵可使空氣、生產車間、工具、發酵設備等環境中的微生物通過大量繁殖而進入酒醅內，其中以乳酸菌為主，進而為乳酸乙酯的合成提供大量前體物[8-9]。近年來，隨著白酒機械化和清潔生產的推廣，釀酒環境衛生、勞動生產環境的改善[10]，使得釀酒環境中乳酸菌的種類和數量減少，尤其在冬季干燥的氣候條件下，易造成發酵體系中乳酸菌的數量不足，致使成品酒中乳酸和乳酸乙酯含量下降，使得酒體香味失衡。因而迫切需要開發富含乳酸乙酯的調味酒用于基酒的勾調，以彌補基酒乳酸乙酯的不足，保證酒體風味協調，提高基酒的質量。

目前，國內對于生物酯化液的研究較多的是利用黃水等發酵副產物在酯化酶作用下催化生成己酸乙酯[11-14]，并將其運用于濃香型白酒的增香與調味酒的生產[15]。而對于酯化生成乳酸乙酯的酯化技術研究較少[16-17]，關于利用酯化酶在水相中催化合成乳酸乙酯酯化液并應用于白酒勾調的相關研究更是鮮有報道[18]。有文獻報道[19]，南極假絲酵母（Candida antarctic）脂肪酶B更適合在以非極性溶劑為催化介質的反應體系中催化酯化反應。因此，本研究利用自老白干酒醅中分離獲得的一株高產乳酸干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）發酵制得乳酸發酵液，通過南極假絲酵母（Candida antarctic）脂肪酶B催化乳酸發酵液與酒尾合成乳酸乙酯，并通過單因素試驗和正交試驗對其催化工藝進行優化，最后生產用于基酒勾調的乳酸乙酯調味酒，旨在彌補冬季生產時基酒中乳酸乙酯含量不足的問題，同時最大限度利用酒尾中的有益成分，提高資源綜合利用率，實現清潔生產。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）：自老白干酒醅中分離獲得，并保藏于本研究室。

1.1.2 試劑

酒尾：老白干酒廠；大米、麥根：市售；南極假絲酵母脂肪酶B（作用pH值2.5～8.0，作用溫度15～55 ℃）：諾維信（中國）生物科技公司；葡萄糖、牛肉膏、蛋白胨、酵母膏（均為生化試劑）：天津市北方天醫化學試劑廠；其他化學試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基

MRS培養基[20]：葡萄糖20.0 g、蛋白胨10.0 g、牛肉膏10.0 g、酵母膏5.0 g、檸檬酸二胺2.0 g、K2HPO42.0 g、乙酸鈉8.0 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、MnSO4·4H2O 0.05 g、Tween-80 1.0 mL，蒸餾水1 000 mL，自然pH，115 ℃高壓滅菌20 min。

乳酸發酵培養基[20]：大米粉30.0 g，麥根粉3.0 g，蒸餾水175 mL，加液化酶5 U/g大米粉，90 ℃液化30 min，加熱煮沸0.5 h，待溫度降至60 ℃，添加糖化酶150 U/g大米粉，于60 ℃水浴鍋中恒溫糖化4 h，降溫至40 ℃時，添加活化好的酸性蛋白酶5 U/g大米粉，過濾，調節糖度為16°Bx，自然pH，115 ℃高壓滅菌20 min。

1.2 儀器與設備

Sever Easy型pH計：瑞士梅特勒托利多儀器有限公司；Agilent1260-紫外高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀：美國安捷倫科技公司；FA2204B電子天平：上海精密儀器有限公司；DHP恒溫培養箱：上海智誠分析儀器制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 乳酸發酵液制備

干酪乳桿菌的活化：取一環保藏于斜面上的干酪乳桿菌接種于裝有10 mL MRS液體培養基的試管中，30 ℃條件下靜置培養24 h。

種子液的制備：將活化好的干酪乳桿菌培養液按10%（V/V）的接種量轉接于裝有100 mL MRS液體培養基的250 mL三角瓶中，30 ℃條件下靜置培養24 h。

將干酪乳桿菌種子液按10%（V/V）的接種量轉接于裝有100 mL乳酸發酵培養基的250 mL三角瓶中，添加3.5%無菌碳酸鈣，密封，于35 ℃條件下靜置發酵15 d，乳酸含量達到80 g/L左右，待用。

1.3.2 乳酸乙酯酯化液制備

將酒精度為40%vol的酒尾與乳酸發酵液按體積比1∶1混勻（總體系100 mL），用1.0 mol/L NaOH及1.0 mol/L H2SO4溶液調節混合液的pH值為3.5，添加南極假絲酵母脂肪酶B 0.5 g，于30 ℃條件下靜置反應14 d后測定乳酸乙酯含量。

1.3.3 脂肪酶催化合成乳酸乙酯條件優化單因素試驗

依據脂肪酶的催化反應特性[21-22]，采用單因素輪換法依次考察pH值（2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0）、反應溫度（25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃）、酶用量（0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%）、反應時間（7 d、10 d、14 d、18 d、21 d、25 d、30 d）及酒尾與乳酸發酵液體積比（1.0∶4.0、1.0∶2.5、1.0∶1.5、1.0∶1.0、1.5∶1.0、2.5∶1.0）對脂肪酶催化合成乳酸乙酯的影響。

1.3.4 脂肪酶催化合成乳酸乙酯條件優化正交試驗

根據單因素試驗結果，考慮到混合液的自然pH值在3.0左右，且酯化液主要用于白酒調味酒的生產，確定正交試驗pH值為3.0。選取反應溫度（A）、反應時間（B）、酶用量（C）、酒尾與乳酸發酵液體積比（D）為考察因素，乳酸乙酯含量（Y）為評價指標，采用L9（34）正交表進行正交試驗，以確定該脂肪酶催化合成乳酸乙酯最佳條件組合。正交試驗因素與水平設計見表1。

表1 脂肪酶B催化合成乳酸乙酯條件優化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal tests for optimization of ethyl lactate synthesis conditions catalyzed by lipase B

1.3.5 高乳酸乙酯調味酒的制備

準確量取5份相同的高乳酸乙酯酯化液于蒸餾裝置中分別蒸餾、濃縮，接取酒精度分別為35%vol、40%vol、45%vol、50%vol、60%vol的餾出液，通過比較不同酒精度下餾出液的乳酸乙酯含量及色澤和外觀，確定最適的調味酒酒精度。

1.3.6 分析方法

2 結果與分析

2.1 脂肪酶催化合成乳酸乙酯條件優化單因素試驗結果與分析

2.1.1 pH值對乳酸乙酯合成的影響

pH值對乳酸乙酯合成的影響見圖1。

圖1 pH值對乳酸乙酯合成的影響Fig.1 Effect of pH on synthesis of ethyl lactate

由圖1可知，隨著反應液pH的增加，乳酸乙酯含量呈先增加后減少的趨勢。當反應液pH值為3.0時，乳酸乙酯含量達到最大值，為9.47 g/L；當pH值＜3.0之前，乳酸乙酯含量相對較高，說明酸性環境較有利于乳酸乙酯的合成；而當pH＞3.0之后，隨著pH值的增加，乳酸乙酯含量急劇下降，分析原因可能是由于隨著pH值的升高，酯化酶的催化活性逐漸降低。因此，確定催化體系的最佳pH值為3.0。

2.1.2 反應溫度對乳酸乙酯合成的影響

反應溫度對乳酸乙酯合成的影響結果見圖2。

圖2 反應溫度對乳酸乙酯合成的影響Fig.2 Effect of reaction temperature on synthesis of ethyl lactate

由圖2可知，隨著反應溫度的升高，乳酸乙酯含量呈先增加后減少的趨勢。當反應溫度為30 ℃時，乳酸乙酯含量達到最大值，為9.64 g/L。分析原因可能是由于在一定溫度范圍內，酶活力隨反應溫度的增加而逐漸升高；當達到酶的最適溫度時，酶的活性達到最大，催化效率最高；當超過酶的最適溫度時，酶活性則開始下降。因此，確定最適反應溫度為30 ℃。

2.1.3 酶用量對乳酸乙酯合成的影響

要抓住黨員領導干部這個“關鍵少數”，把憲法法律教育納入黨員干部學習教育體系。各級人大、政府、監委、法院、檢察院等國家機關更要把學習憲法作為履行職責的基本功和必修課，真正使黨員干部特別是領導干部牢固樹立憲法法律至上、法律面前人人平等的法治理念，不斷提高運用法治思維和法治方式解決問題的能力和水平，切實做到依法用權、秉公用權。各級黨員領導干部要自覺先學一步、學深一層，熟知憲法文本，提高憲法意識，筑牢法治信仰，切實發揮好示范引領作用。

酶用量對乳酸乙酯合成的影響結果見圖3。

圖3 酶用量對乳酸乙酯合成的影響Fig.3 Effect of enzyme addition on synthesis of ethyl lactate

由圖3可知，隨著酶添加量的增加，乳酸乙酯含量呈先增加后減少的趨勢。當酶添加量為0.4%時，乳酸乙酯含量達到最大值，為9.76 g/L；當酶添加量＞0.4%之后，乳酸乙酯含量下降。分析原因可能是在一定的酶濃度范圍內，酶濃度越大，酶與反應底物的接觸幾率越大，酶的催化反應效果越好，但當酶濃度相對于底物濃度接近飽和時，酶濃度對催化效果影響較小。因此，確定最佳的脂肪酶添加量為0.4%。

2.1.4 反應時間對乳酸乙酯合成的影響

反應時間對乳酸乙酯合成的影響結果見圖4。

圖4 反應時間對乳酸乙酯合成的影響Fig.4 Effect of reaction time on synthesis of ethyl lactate

由圖4可知，隨著反應時間的延長，乳酸乙酯的含量呈先增加后減少的趨勢。當反應21 d時，乳酸乙酯含量達到最大值，為10.08 g/L；當反應時間＞21 d之后，乳酸乙酯含量下降，說明在第21天時底物的轉化合成率達到最高，而繼續增加反應時間，脂肪酶則主要表現出水解作用，使反應向著水解乳酸乙酯的方向進行。因此，確定該體系下合成乳酸乙酯的最佳反應時間為21 d。

2.1.5 酒尾與乳酸發酵液體積比對乳酸乙酯合成的影響

酒尾與乳酸發酵液體積比對乳酸乙酯合成的影響結果見圖5。

圖5 酒尾與乳酸發酵液體積比對乳酸乙酯合成的影響Fig.5 Effect of tailing liquor to lactic acid fermentation broth ratio on synthesis of ethyl lactate

由圖5可知，隨著酒尾與乳酸發酵液體積比的增加，即乙醇含量逐漸提高，乳酸含量逐漸降低，乳酸乙酯含量呈現先增加后減少的趨勢。當酒尾與乳酸發酵液體積比為1.0∶1.0時，乳酸乙酯含量達到最大值，為10.59 g/L。分析原因可能是：酯化反應作為一種可逆反應，在一定范圍內底物乳酸與乙醇含量的增加會促進酯化反應向合成乳酸乙酯的正方向進行，而當底物濃度過低時酯化酶則會催化反應向水解酯的逆方向進行；反應底物濃度太高會抑制脂肪酶的催化活性，甚至失去酶活性。因此，確定該體系下酒尾與乳酸發酵液的最佳體積比為1.0∶1.0。

2.2 脂肪酶催化合成乳酸乙酯條件優化正交試驗結果與分析

2.2.1 正交試驗結果與方差分析

根據單因素試驗結果，以乳酸乙酯含量（Y）為評價指標，選取反應溫度（A）、反應時間（B）、酶用量（C）、酒尾與乳酸發酵液體積比（D）4個因素進行4因素3水平正交試驗，結果與分析見表2，方差分析見表3。

由表2極差分析可知，各因素對結果影響的主次順序為D＞A＞B＞C，即酒尾與乳酸發酵液體積比＞反應溫度＞反應時間＞酶添加量；該酯化酶催化合成乳酸乙酯的最佳條件組合為A2B2C3D2，即反應溫度30 ℃，反應時間21 d，酯化酶添加量0.5%，酒精度40%vol的酒尾與乳酸發酵液體積比1.0∶1.0。由表3方差分析結果可知，反應溫度和酒尾與乳酸發酵液體積比對乳酸乙酯催化合成有顯著影響（P＜0.05），而其他因素對結果影響不顯著（P＞0.05）。

表2 脂肪酶B催化合成乳酸乙酯條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal tests for optimization of ethyl lactate synthesis condition catalyzed by lipase B

表3 正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal tests results

2.2.2 最優組合驗證

按照上述正交試驗得到的乳酸乙酯最佳合成條件組合進行了5次平行驗證性試驗，乳酸乙酯含量為（12.05±0.06）g/L。高于正交試驗中的任何一組；且相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）為0.51%，說明該乳酸乙酯酯化液合成制備工藝穩定、可行。

2.3 高乳酸乙酯調味酒的制備

不同酒精度下餾出液的乳酸乙酯含量及色澤見表4。

表4 調味酒酒精度對乳酸乙酯含量和酒體色澤的影響Table 4 Effect of alcohol content of flavoring liquor on ethyl lactate content and liquor body color

由表4可知，隨著調味酒酒精度的降低，乳酸乙酯的含量逐漸升高，當酒精度＜45%vol之前，酒體逐漸出現渾濁現象。分析原因可能是由于酒尾中含有大量沸點較高的酯類、酸類，這些物質難溶于水，易溶于乙醇。因而最終確定最適調味酒酒精度為45%vol，此時酒體無色透明、無懸浮物、無沉淀，乳酸乙酯香味突出，乳酸乙酯含量達17.62 g/L，可用于乳酸乙酯含量偏低基酒的勾兌與調味。

3 結論

本研究通過單因素及正交試驗確定南極假絲酵母脂肪酶B催化酒尾和干酪乳桿菌乳酸發酵液合成乳酸乙酯的最佳催化合成工藝為酒精度40%vol的酒尾與乳酸發酵液體積比1.0∶1.0，pH值3.0，脂肪酶添加量0.5%，反應溫度30 ℃，反應時間21 d。在此最優催化合成條件下，酯化液中乳酸乙酯含量達12.05 g/L。酯化液經蒸餾、濃縮后，以酒精度為45%vol的餾出液作為調味酒，此時調味酒中乳酸乙酯含量最高，為17.62 g/L，酒體清澈透明，酯香突出，適用于勾調冬季或機械化生產中乳酸乙酯含量偏低的基酒，增加乳酯含量，穩定和改善固液結合白酒或液態發酵白酒的質量，提高經濟效益。