反吹-氣相色譜法快速檢測啤酒中的主要風味物質

楊 珍，賀立東

（1.鎮江市高等專科學校 醫藥與化材學院，江蘇 鎮江 212028；2.鎮江市功能化學重點實驗室，江蘇 鎮江 212028；3.華潤雪花啤酒（中國）有限公司技術中心，天津 300400）

啤酒是人們日常生活中不可或缺的飲品之一。啤酒的口感與醇香主要由風味物質保持，盡管風味物質的濃度很低，但成分非常復雜，已檢出的就有上百種，包括醇類、酯類、酸類、醛類、酮類、硫化物、酚類化合物等[1-5]。其中風味閾值低、含量較高的乙醛、二甲基硫、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、異戊醇、己酸乙酯和辛酸乙酯等化合物對啤酒風味影響最大。LI H M等[6-8]對啤酒釀造過程及原料中的風味化合物和異味組分進行了分析研究，以氣相色譜（gas chromatography，GC）法為主，在此基礎上發展了氣相色譜-氣味檢測技術（gas chromatographyodor detection technology，GCO）[9]、電子自旋技術[1，10]、核磁共振技術[11]以及氣質聯用（gas chromatograph-mass spectrometer，GC-MS）技術等[12-18]。眾所周知，氣相色譜法中采用直接進樣簡便，無制備損失與污染，苗延林等[19]就嘗試過直接進樣法，但是啤酒本身的黏度較大，其中不揮發組分會使色譜柱污染，所以在采用氣相色譜法分析或是各種聯用技術時，很少采用直接進樣的方式，一般都要進行預處理。常用的預處理方法有溶劑萃取法[5，14]、頂空（headspace，HS）分析法[6，11]、固相微萃取法（solid-phase microextraction，SPME）等[16，20]。但是這些方法所需要的儀器昂貴，前處理工序復雜，花費時間較多，因此這些方法不利于啤酒企業生產過程中優化工藝的快速分析。

隨著啤酒生產規模化、集團化發展，主要風味物質的快速檢出對啤酒的釀造過程控制和啤酒質量起關鍵作用。本實驗利用氣相色譜儀及其反吹微板流控裝置，對啤酒直接進樣，建立了一種快速分析啤酒中主要風味物質的氣相色譜分析方法。該方法簡單易行，有效降低樣品基質的影響，縮短樣品的檢測運行時間，減少材料消耗，能及時、有針對性地控制啤酒類生產工藝中風味物質的含量，提高啤酒的質量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙醛、二甲基硫（dimethyl sulfide，DMS）、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、正丁醇、異戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯（均為色譜純）、無水乙醇（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 7890A氣相色譜儀（配有分流/不分流進樣口、火焰離子化檢測器（flame ionization detector，FID）、液體自動進樣器及微板流路控制反吹裝置（QuickSwap））：美國安捷倫公司；ME204分析天平：梅特勒托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 標準儲備溶液的制備

在100 mL 容量瓶中加入適量無水乙醇，用電子天平準確稱取乙酸乙酯0.834 4 g，正丙醇0.603 3 g，辛酸乙酯0.066 5 g，乙酸異戊酯0.093 5 g，己酸乙酯0.081 0 g，乙酸異丁酯0.049 0 g，二甲基硫0.024 6 g，無水乙醇定容，制成標準儲備液一；另取100 mL 容量瓶，加入適量無水乙醇后，準確量取10 mL標準儲備液一加入，再準確稱取加入異丁醇0.295 2 g，異戊醇1.734 6 g，乙醛0.187 8 mg，然后用無水乙醇定容，然后用無水乙醇定容，制成標準貯備液二，冰箱貯存待用（0～5 ℃）。

1.3.2 正丁醇內標溶液的制備

準確稱取正丁醇0.4 g于預先加入適量無水乙醇的100 mL容量瓶中，用無水乙醇定容，冰箱貯存待用。

1.3.3 標準曲線的制作

準確移取10 μL、20 μL、40 μL、60 μL、80 μL標準儲備液二，分別于預先加入10 mL去離子水的比色管中，再分別加入50 μL正丁醇內標溶液（此時正丁醇內標溶液質量濃度為20 mg/L），輕搖混勻后，進氣相色譜儀分析，分別測得各組分色譜峰和內標峰的峰面積，用內標法制作標準曲線。

1.3.4 啤酒樣品的準備

瓶裝啤酒于冰箱中冷卻至5 ℃左右，開蓋后迅速移取。定性分析時，用標準物質對照保留時間。定量分析時，在裝有10 mL啤酒的比色管中，加入50 μL正丁醇內標溶液，輕搖混勻，氣相色譜分析，計算各風味物質的質量濃度。

1.3.5 色譜條件

色譜柱：HP-InnowaxAgilent19091N-213（30m×320μm×0.5 μm）；進樣口條件：溫度220 ℃，分流比5∶1，總流速15 mL/min，隔墊吹掃流速3 mL/min。

柱溫箱升溫程序：起始35 ℃，以5 ℃/min升溫至50 ℃，保持2 min，再以15 ℃/min升溫至120 ℃，保持2 min，然后以25 ℃/min升溫至200 ℃，保持2 min。

色譜柱載氣流量程序：2mL/min保持9min，以100mL/min降至9.5mL/min，保持1.5min，再以100mL/min降至0.1mL/min，保持2.5 min。

色譜柱出口壓力8.366 5 psi。Quick swap 壓力程序：起始壓力8.366 5 psi，保持10.6 min，然后以100 mL/min升至83.665 psi，保持2.5 min。

FID條件：溫度280 ℃，氫氣流量60 mL/min，空氣流量500 mL/min，尾吹流量25 mL/min。進樣量：1 μL。

2 結果與分析

2.1 定性結果

在上述色譜條件下，對標準溶液進行測定，用標準物質對照保留時間定性，可得啤酒中主要風味物質的色譜圖（圖1），各標準物質的保留時間見表1。由圖1及表1可知，乙醛、二甲基硫、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、異戊醇、己酸乙酯和辛酸乙酯10種成分都能檢出。此方法靈敏度高、檢測的組分都實現基線分離和自動積分，并且分析時間較短，約11 min，操作簡便，快速又準確。

圖1 啤酒中主要風味物質混合標準樣品溶液氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of the standard mixture of main flavor compounds in beer

表1 標準樣品組分保留時間Table 1 Retention time of standard mixture

2.2 繪制標準曲線

將配制的啤酒風味物質標準溶液用內標法在上述色譜條件下進樣，分別測定其與內標液正丁醇的峰面積比，并以此為縱坐標，標準液中各物質與正丁醇的質量比為橫坐標，繪制標準曲線。重復進樣進行3次測定。結果如表2所示。由表2可知，10種風味物質都具有良好的線性關系（見所得線性回歸方程），其中乙酸異戊酯的相關系數能達到0.999 97。除正丙醇和異戊醇之外，其他組分的相對標準偏差（rlative sandard deviation，RSD）都＜1.5%。試驗精密度較高，說明該方法能較準確地定量分析啤酒中主要風味成分。

表2 啤酒中主要風味物質的線性回歸方程Table 2 Linear regression equation of main flavor compounds in beer

2.3 實際啤酒樣品的測定及重復性實驗

采用上述分析方法測定了某品牌啤酒中主要風味物質的含量，進樣5次。結果如表3所示。由表3可知，該方法能有效地檢測成品啤酒中乙醛、二甲基硫、乙酸乙酯、乙酸異丁酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、異戊醇、己酸乙酯和辛酸乙酯10種風味成分，5次進樣，重現性高，精密度較高。

表3 啤酒中風味物質含量檢測結果Table 3 Determination results of flavor compounds contents in beer mg/L

2.4 加標回收實驗

取10.0 mL啤酒，加入30 μL標準儲備液二，再加入內標液正丁醇50 μL，用內標法進行測定，計算回收率，結果見表4。從表4可以看出，同一樣品回收率測定結果均在96%～104%，符合色譜分析的回收率要求，滿足日常分析需要。

表4 加標回收率實驗結果Table 4 Results of adding standard recovery rates

2.5 討論

本方法通過使用微板流控裝置實現反吹，優點主要體現如下：一是每次啤酒樣品中所需分析的目標物出峰之后，高沸點物質可以通過反吹從分流口反向排出，因此幾乎沒有基質殘留于色譜柱中，使分析的準確性得以提高；二是由于增加了反吹功能，實現了啤酒樣品的直接進樣，相對于常用的頂空進樣，避免了復雜的前處理，因此每次樣品分析的時間縮短，可以實現快速分析；三是反吹有效保護了色譜柱，既提高了樣品分析的穩定性，又延長了色譜柱的壽命，節約成本，特別適用于工業化質控分析。

3 結論

本文采用氣相色譜儀及其反吹微板流控裝置，對啤酒進行直接進樣分析，建立了一種快速分析啤酒中主要風味物質的氣相色譜分析方法。該方法無需對樣品進行前處理，操作簡單，定量數據準確可靠，分析周期短，是啤酒生產企業快速檢測的一種理想分析方法。