不同發酵方式制備樹莓-石榴復合果汁酵素的抗氧化活性研究

覃 引，熊音如，盧 麗，邊 疆，張群英

（1.貴州理工學院 食品藥品制造工程學院，貴州 貴陽 550003；2.貴州大學 生命科學學院，貴州 貴陽 550025；3.貴州貴山紅農業發展有限公司，貴州 貴陽 550018）

酵素是通過益生菌發酵一種或多種新鮮蔬菜、水果、菌菇、中草藥等而成的一種功能性液體或固體，因富含酶、維生素、微量元素、氨基酸和多酚等營養物質，受到國內外研究者的重視，具有極大的發展潛力[1]。近年來，水果酵素的制備與抗氧化活性研究逐漸成為熱點，水果酵素具有較強的抗氧化能力，對人體內的自由基有清除作用[2]。林冰等[3]利用自然發酵的方式制備刺梨酵素，并研究發現，發酵過程中刺梨酵素有較好的抗氧化活性；張巧等[4]采用自然發酵的方式制備大果山楂酵素，并研究發現，在發酵至15～25 d時，大果山楂酵素抗氧化能力最強；李世燕等[5]以毛酸漿為原料，采用不同發酵工藝制備酵素，并對酵素發酵過程中的抗氧化活性進行研究發現，不同發酵工藝制得毛酸漿酵素均有較強的抗氧化性。

樹莓（Rubus idaeus）及石榴（Punica granatum）富含多酚類化合物，具有較強的抗氧化能力[6]。嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）具有減輕乳糖不耐受癥、預防胃炎和感染性腹瀉等作用[7]。干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）具有降低膽固醇的作用[8-9]。

因此，本實驗以樹莓和石榴復合果汁為原料，采用自然發酵、單一添加嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）、單一添加干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）及同時添加嗜熱鏈球菌和干酪乳桿菌發酵四種方式制備酵素，并對其發酵過程中的pH值、總酚含量、總黃酮含量、羥自由基（·OH）清除能力、超氧離子自由基（O2-·）清除率及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力進行測定，以期確定合適的制備工藝，為樹莓、石榴等水果的加工開發提供理論依據，提高樹莓、石榴的附加值并利于當地農產品加工發展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

樹莓：貴州貴山紅農業發展有限公司；石榴：貴州水城縣南亞生態農業發展有限公司。

1.1.2 菌株

嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus，ST）、干酪乳桿菌亞種（Lactobacillus casei，LC）：中國工業微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 試劑

DPPH（分析純）：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；福林酚（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；MRS培養基：上海博微生物科技有限公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV5500型紫外-可見分光光度計：上海元析儀器有限公司；HH-4D數顯恒溫水浴鍋：常州澳華儀器有限公司；SHZF-4263臺式氣浴全溫振蕩培養箱：成都瑞昌儀器制造有限公司；JB-CJ-2FXS潔凈工作臺：無錫優派科技有限公司；GR60DA立式自動壓力蒸汽滅菌器：致徽（廈門）儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種的活化與擴培

挑取適量的嗜熱鏈球菌凍干粉、干酪乳桿菌凍干粉分別接種至5 mL MRS液體培養基中，37 ℃、180 r/min條件下培養24 h，按接種量2%（V/V）分別接種至100 mL MRS液體培養基中，37 ℃、180 r/min條件下培養36～48 h，待用。

1.3.2 樹莓-石榴復合果汁的制備

參考程勇杰等[10]的方法稍作修改：用無菌水洗滌生果，然后用體積分數95%乙醇進行表面消毒，再用無菌水沖洗。將樹莓、石榴與無菌水按質量比0.5∶0.5∶1.0混合，粉碎成漿液，裝至1 000 mL錐形瓶中，在37 ℃、180 r/min條件下振蕩3 h。四層紗布過濾漿液得到澄清的樹莓-石榴復合果汁，用無菌水稀釋2倍后分裝至250 mL錐形瓶各100 mL。

1.3.3 樹莓-石榴復合果汁酵素的制備

參考李豆[11]的方法稍作修改：向樹莓-石榴復合果汁中分別加入1%嗜熱鏈球菌，1%干酪乳桿菌，0.5%嗜熱鏈球菌和0.5%干酪乳桿菌，37 ℃、180 r/min條件下培養96 h。每12 h取樣，4 500 r/min離心10 min，取上清液。以自然發酵制備的樹莓-石榴復合果汁酵素為對照，測定不同發酵方式制備的樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中pH值、總酚含量、總黃酮含量及抗氧化活性的變化。

1.3.4 測定方法

pH值：采用pH計進行測定。

總酚含量：參照文獻[12]的方法。以沒食子酸質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，建立沒食子酸標準曲線。根據沒食子酸標準曲線的回歸方程，對總酚含量進行計算。

總黃酮含量：參照文獻[13]的方法。以蘆丁質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，建立蘆丁標準曲線。根據蘆丁標準曲線的回歸方程，對總黃酮含量進行計算。

羥自由基清除率：參照文獻[14]的方法測定樹莓-石榴復合果汁酵素對羥自由基的清除能力。

DPPH自由基清除率：參考文獻[15]的方法測定樹莓-石榴復合果汁酵素對DPPH自由基的清除能力。

超氧陰離子自由基清除率：參考文獻[16-17]的方法并稍作修改。向1 mL樣品中加入3 mL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.2），混勻，加入0.2 mL鄰苯三酚（2.5 mmol/L），混勻，反應4 min，再加入10 mol/L HCl 2滴終止反應，采用紫外分光光度計測定波長320 nm處的吸光度值（A）。鄰苯三酚（2.5 mmol/L）自氧化4 min，測定波長320 nm處的吸光度值（A0）。以Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.2）作為空白對照，重復3次試驗。計算超氧陰離子清除率，其計算公式如下：

1.3.5 數據分析

采用OriginPro9.0軟件繪圖，每組實驗重復3次，使用SPSS25.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中pH值的變化

不同發酵方式制備的樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中pH值的變化見圖1。

圖1 樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中pH值的變化Fig.1 Change of pH during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme

由圖1可知，4種發酵方式制備的樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中pH值的變化趨勢一致，在發酵0～12 h時，pH值上升；發酵12～24 h時，pH急速下降；發酵24～60 h時，pH值緩慢下降。發酵12 h后pH值不斷降低，主要是因為隨著糖的消耗，發酵液中有機酸的不斷生成使pH值降低，其次在微生物生長和代謝過程中利用果汁中的糖類產生大量CO2，一部分CO2溶于發酵液中也有可能導致pH值降低；同時生成的CO2使得瓶內充滿氣泡，導致pH值有波動。當發酵96 h后，pH值趨于穩定，分析原因可能是由于pH值過低會影響微生物的生長，最終pH值降至3.52。結果表明，較低的pH值利于發酵進行。

2.2 樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中總酚含量的變化

以沒食子酸的質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，建立沒食子酸標準曲線，結果見圖2。由圖2可知，沒食子酸標準曲線的線性回歸方程為y=47.757x-0.015 2，相關系數R2=0.999 1，說明線性關系良好，可用于總酚含量的測定。

圖2 沒食子酸標準曲線Fig.2 Standard curve of gallic acid

不同發酵方式制備的樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中總酚含量的變化見圖3。

圖3 樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中總酚含量的變化Fig.3 Change of total phenols contents during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme

由圖3可知，樹莓-石榴復合果汁酵素在發酵過程中，隨著發酵時間的延長，總酚含量先增加后降低。除自然發酵外，其他3種發酵方式發酵72 h時，總酚含量均達到最大，其中混菌發酵方式的總酚含量最高，為0.57 mg/mL，因此，混菌發酵方式最好?？偡雍砍氏仍黾雍蠼档偷脑蚩赡苁窃诎l酵前期，微生物將大分子酚類物質轉變成小分子酚類[18]，也可能由于發酵微生物對多酚復合物的酶促降解[19]，導致總酚含量增加。發酵過程中微生物可能代謝產生CO2和水，使發酵液濃度降低，從而使后期總酚含量下降[20]。

2.3 樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中總黃酮含量的變化

以蘆丁質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標，建立蘆丁標準曲線，結果見圖4。由圖4可知，蘆丁標準曲線的線性回歸方程為y=1.314 9x+0.028 3，相關系數R2=0.999 1，線性關系良好，可用于總黃酮含量的測定。

圖4 蘆丁標準曲線Fig.4 Standard curve of rutin

不同發酵方式制備的樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中總黃酮含量的變化見圖5。

圖5 樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中總黃酮含量的變化Fig.5 Change of the total flavonoids contents during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme

由圖5可知，4種發酵方式制備的樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中總黃酮含量的變化趨勢一致，均呈現先升高后下降的趨勢。采用混菌和干酪乳桿菌發酵60 h時，總黃酮含量達到最高，分別為0.41 mg/g、0.36 mg/g。采用嗜熱鏈球菌和自然發酵72 h時，總黃酮含量達到最高，分別為0.33 mg/g、0.27 mg/g。結果表明，混菌發酵方式最好。發酵過程中總黃酮含量的增加可能是微生物產生的某種酶類使黃酮苷水解成黃酮苷元導致總黃酮含量增加。后期由于pH值的不斷降低，黃酮苷元的溶解度逐漸減小最終從溶液中析出，導致黃酮類化合物含量降低。也有可能是因為發酵時間過長后，黃酮本身被水解所致[21]。

2.4 樹莓-石榴復合果汁酵素抗氧化活性研究

2.4.1 樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中羥自由基清除率的變化

不同發酵方式制備的樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中羥自由基清除率的變化見圖6。

圖6 樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中羥基自由基清除率的變化Fig.6 Change of hydroxyl radical scavenging rate during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme

由圖6可知，除自然發酵方式外，其余3種發酵方式酵素的羥自由基清除能力隨著發酵時間的延長，呈上升下降交替變化的波動趨勢。采用混菌和干酪乳桿菌發酵72 h時，羥自由基清除率達到最大，分別為67.1%、48.5%，而采用嗜熱鏈球菌發酵60 h時，羥自由基清除率達到最大，為41.9%。有研究表明，微生物在代謝過程中會產生一些胞外清除自由基的活性物質（如胞外多糖等）能提高羥基自由基的清除率[22-23]。發酵后期羥基自由基清除率降低可能原因是溫度較高影響發酵液的穩定性所致。結果表明，混菌發酵方式最好。

2.4.2 樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中DPPH自由基清除率的變化

不同發酵方式制備的樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中DPPH自由基清除率的變化見圖7。

由圖7可知，采用嗜熱鏈球菌與混菌發酵時，DPPH自由基清除率先增加后降低，60 h時達到最高，分別為79%、94%；采用干酪乳桿菌發酵0～60 h時，隨著發酵時間的延長，DPPH自由基清除率呈上升趨勢，但略有波動，在60 h時達到最高（69%）后迅速下降，后趨于平穩；自然發酵過程中，DPPH自由基清除率緩慢上升后趨于平穩。有研究表明，乳桿菌能使黃酮轉化為游離的黃酮苷元，而游離態的苷元抗氧化能力更強，這有可能是DPPH自由基清除率提高的原因之一[24-25]。

圖7 發酵過程中DPPH自由基清除率的變化Fig.7 Change of DPPH radical scavenging rate during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme

2.4.3 樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中超氧陰離子清除活性的變化

不同發酵方式制備的樹莓-石榴復合果汁酵素發酵過程中超氧陰離子清除率的變化見圖8。

圖8 發酵過程中超氧陰離子自由基清除率的變化Fig.8 Changes of superoxide anion radical scavenging rate during the fermentation of Rubus idaeus-Punica granatum compound juice enzyme

由圖8可知，隨著發酵時間的延長，4種發酵方式制備的樹莓-石榴復合果汁酵素的超氧陰離子自由基清除率均呈先升高后緩慢降低的趨勢，且采用混菌方式發酵72 h時，超氧陰離子自由基清除率最高為54%，表明混菌發酵方式最好。

3 結論

與單一嗜熱鏈球菌發酵、單一干酪乳桿菌發酵、自然發酵相比，嗜熱鏈球菌和干酪乳桿菌混菌發酵方式最優，能增加樹莓-石榴復合果汁酵素中總酚含量、總黃酮含量，提高抗氧化能力?；炀l酵72 h時，總酚含量（0.57 mg/mL）、·OH清除率（67%）及O2-·清除率（54%）最高；發酵60 h時，總黃酮含量（0.41 mg/g）及DPPH自由基清除率（94%）最高；發酵過程中，pH值最低，且變化最小，利于發酵的進行。