基于高通量測序濃香型和芝麻香型白酒酒曲真菌群落結構的分析

李 斌，胡俊杰，張蘭蘭，李紹亮，李學思，郭書賢

（1.南陽理工學院 生物與化學工程學院，河南 南陽 473004；2.河南省工業微生物資源與發酵技術重點實驗室，河南 南陽 473004；3.河南省宋河酒業股份有限公司，河南 鹿邑 477265）

在我國常采用大曲、小曲和麩曲生產白酒，固態發酵生產白酒方法中，大曲既是一種粗制酶制劑，又是一種糖化發酵劑，同時也起生香作用[1]。由于大曲是自然培養而成的，所以含有霉菌、酵母、細菌等多種微生物種群及其產生的蛋白酶酶系、淀粉酶酶系及風味酶酶系等復合酶系，是一種多菌種的混合酶制劑，為形成復雜的香氣成分起重要作用，由此可見，曲的優劣與酒的質量和酒體風格直接相關，名酒之所以為名酒，名在質量，貴在風格。微生物在白酒釀造中起著主要作用，因此了解微生物在酒曲培養以及白酒釀造過程中的習性和作用，不僅有利于提高白酒質量，而且可滿足消費者對于曲酒類型的不同需求以及對曲酒品質的要求[2]。

傳統的平板培養或聚合酶鏈式反應-變性梯度凝膠電泳（polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE）等技術只能對大曲中少數可以分離培養的菌種進行研究，具有很大的局限性，而高通量測序（high-throughput sequencing，HTS）技術具有高通量、高分辨率的優勢，為準確揭示微生物菌群的多樣性提供了強有力的手段，能夠充分展示微生物菌群的多樣性[3]。目前，Rocher 454、Illumina和Iontorrent是廣泛應用的高通量測序平臺，Miseq是Illumina開發的第二代高通量測序技術，具有成本低、準確率高、操作簡便的優點，已被廣泛且成功地應用于食品[4]、土壤[5-6]、水資源[7-8]等的微生物菌群分析，但目前應用高通量測序技術對白酒釀造大曲的真菌的研究報道還比較少。

本實驗采用高通量測序技術，利用Illumina公司Miseq測序平臺對濃香型白酒的中高溫曲和芝麻香型白酒的高溫曲中的真菌多樣性進行研究，建立一套高通量測序技術分析白酒酒曲真菌的方法，同時通過數據分析，完整的解析兩種酒曲中真菌的群落結構。為建立濃香型白酒酒曲和芝麻香型白酒酒曲的微生物信息數據庫，優化酒曲的發酵工藝和提升品質提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

濃香型白酒中高溫曲（1月齡、2月齡、4月齡，分別命名為Z1、Z2、Z3）、芝麻香型白酒高溫曲（命名為AA1）：均取自河南省宋河酒業股份有限公司。樣品采集后迅速粉碎密封，-20 ℃保存備用。

1.1.2 主要試劑

Taq脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）聚合酶（5 U/μL）：美國Thermo公司；E.Z.N.A.Soil DNA提取試劑盒：美國OMEGA公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒：生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit2.0 DNA檢測試劑盒：美國Life公司。

1.2 儀器與設備

Mastercycler PCR儀：德國Eppendorf公司；Pico-21臺式離心機：美國Thermo Fisher公司；GL-88B漩渦混合器：其林貝爾儀器制造有限公司；TND03-H-H混勻型干式恒溫器：拓能達科技有限公司；DYY-6C型電泳儀：北京六一儀器廠；GelDoc-ItTS3凝膠成像系統：美國UVP公司；Miseq高通量測序儀：美國Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

酒曲中微生物總DNA的提取按照DNA提取試劑盒說明書中的方法和步驟進行。

1.3.2 聚合酶鏈式反應及測序

以總DNA為模板，采用Miseq測序平臺的通用引物ITS1（5'-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'）和ITS2-Rev（5'-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）對酒曲中真菌的ITS序列進行PCR擴增。

PCR擴增體系：10×PCR buffer 5 μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）0.1 mmol/L，DNA 10 ng，ITS1 0.5 μmol/L，ITS2-Rev 0.5 μmol/L，PlantiumTaq0.05 U，用雙蒸水補充至50 μL。

PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計5個循環；然后94 ℃變性20 s，45 ℃退火20 s，65 ℃延伸30 s，共計20個循環；最后72 ℃延伸5 min。

PCR擴增結束后，PCR擴增產物進行瓊脂糖電泳，利用SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒回收PCR擴增產物。利用Qubit2.0 DNA檢測試劑盒對回收的PCR擴增產物進行精確定量，依托生工生物工程（上海）股份有限公司進行Illumina MiSeq高通量測序。

1.3.3 數據分析

將測序獲取的原始序列的雙末端序列融合成一個方向的序列并進行質量控制（quality control，QC），方法如下：

（1）序列的融合，采用1.2.3 Flash軟件融合雙末端的序列，通過各個樣品的barcode使數據回歸樣品，并對各個樣品序列進行質量控制。

（2）QC分析：采用V0.20.4 Prinseq軟件對序列閱讀框的3'端進行質控，去掉堿基質量（Q）值＜20的數據，提高后續序列的融合比率；通過Flash軟件融合雙末端序列，使其形成一條序列；采用Prinseq軟件去除各個樣品的引物序列、小于200 bp的序列、低質量序列和低復雜度序列；截掉非靶區域序列和嵌合體，首先采用1.30.1 Mothur軟件的Pre.cluster模塊校正測序錯誤，校正過程中允許的最大錯配是1/150。然后，以Silva數據庫中的序列作為模板，采用Uchime功能模塊去掉嵌合體和非靶區域序列。

2 結果與分析

2.1 序列的拼接

采用Illumina Miseq測序平臺得到Z1、Z2、Z3、AA1樣本對應的原始序列分別為49 404條、51 278條、64 658條和98 202條，其平均長度分別為317.72 bp、304.71 bp、296.31 bp和254.15 bp，經拼接、過濾，分別得到有效序列49 389條、51 246條、64 587條和97 934條，其平均長度分別為273.91 bp、261.13 bp、252.28 bp和211.03 bp。

2.2 序列豐富度和多樣性分析

香農（Shannon）指數、ACE指數、Chaol指數、辛普森（Simpson）指數和Coverage指數是常用于描述微生物群落物種多樣性的Alpha多樣性指數，這5個多樣性指數可以對群落物種組成的豐富度及群落物種組成的均勻度進行綜合性的評價，5個多樣性指數中的Shannon指數對微生物群落物種多樣性更為敏感。其中，Shannon指數越大，群落物種的多樣性越高；Chaol指數或ACE指數越大表明群落物種豐富度越高；由Coverage指數可知本次實驗的取樣是否合理，若Coverage指數＞97%，則證明本次取樣是合理的；但Simpson指數值越大，說明群落多樣性越低[9]。基于高通量測序技術對濃香型白酒中高溫曲和芝麻香型白酒高溫曲中真菌的序列數量、操作分類單元（operational taxonomic units，OTU）和Alpha多樣性指數進行研究，結果見表1。

表1 不同酒曲中真菌的序列數量、操作分類單元和Alpha多樣性指數分析結果Table 1 Analysis results of sequence amounts,operational taxonomic units and alpha diversity indexes of fungi in different Jiuqu

由表1可知，盡管Z1、Z2、Z3、AA1樣品對應的Alpha指數在絕對數值上略有差異，但都可以看出測序數據量已足夠大，可以反映樣本中絕大多數的微生物信息。通過對4個樣本對比分析可知，在濃香型白酒中高溫曲中，樣品Z3的Chao1指數值（668.43）最大，說明Z3樣本的真菌群落物種豐富度最高；樣品Z2的Shannon指數值（1.42）最大且Simpson指數值（0.36）最小，說明樣品Z2的真菌群落多樣性最高。芝麻香型白酒高溫曲樣本AA1的Chao1指數值（764.45）和Shannon指數值（2.65）都比濃香型白酒中高溫曲的指數值大，因此，芝麻香型高溫曲的真菌物種豐富度和真菌群落多樣性都比濃香型白酒中高溫曲的大。4個樣品的Coverage指數都＞97%，說明本次取樣是合理的，測序結果能反映樣本的真實情況。

2.3 香農指數曲線分析

香農指數曲線反映樣品中微生物多樣性，可以用于比較測序數據量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用于說明樣本的測序數據量是否合理。當曲線趨向平坦時，說明測序數據量合理，更多的數據量只會產生少量新的OTU，反之則表明繼續測序還可能產生較多新的OTU[10]。

基于高通量測序技術對濃香型白酒中高溫曲和芝麻香型白酒高溫曲中真菌的香農指數進行分析，香農指數曲線如圖1所示。

由圖1可以看出，隨著測定序列數量的增加，稀釋曲線趨向平坦，說明測序數據量漸進合理，取樣情況能較好的說明樣品中涵蓋的所有菌群，樣品Z1、Z2和Z3的稀疏性曲線幾乎在同一曲線上，這是由于3個樣本的Shannon指數值（分別為1.38、1.42和1.34）非常接近，所以微生物群落物種的多樣性幾乎是一樣的，更多的數據量對發現新OTU的邊際貢獻很小。而樣品AA1的稀疏性曲線則高于樣品Z1、Z2和Z3，說明在芝麻香型白酒曲中真菌的物種多樣性高于濃香型白酒中高溫曲中真菌的物種多樣性。

圖1 不同酒曲的香農指數曲線Fig.1 Shannon index curves of different Jiuqu

2.4 基于屬水平各樣本中真菌的種類和相對豐度分析

在屬水平上，基于高通量測序技術對濃香型白酒中高溫曲和芝麻香型白酒高溫曲真菌的種類和相對豐度進行分析，根據相對豐度將樣本中菌屬分為優勢菌屬（相對豐度≥1.0%）和次要菌屬（相對豐度＜1.0%），且將次要菌屬歸類于其他（others），其結果見表2。

表2 不同酒曲中真菌菌屬及相對豐度Table 2 Genus and relative abundance of fungi in different Jiuqu

由表2可知，假絲酵母屬（Candida）是濃香型白酒中高溫曲和芝麻香型白酒高溫曲中的優勢真菌群。隨著濃香型白酒中高溫曲貯存時間的延長，Candida的相對豐度逐漸增加。而曲霉屬（Aspergillus）則正好相反，貯存時間越長菌屬相對豐度越低。除此之外，根毛霉屬（Rhizomucor）的相對豐度是先上升再下降，說明這類菌屬在貯存4個月過程會出現峰值，然后開始下降；熱子囊菌屬（Thermoascus）則是先下降再上升。在濃香型白酒1月齡、2月齡和4月齡的中高溫曲中未分類酵母的含量依次遞減，到4月齡的酒曲中未分類酵母只占0.57%。芝麻香型白酒高溫曲中真菌的物種多樣性高于濃香型白酒曲中真菌的物種多樣性，其主要優勢菌屬是假絲酵母（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）、根毛菌屬（Rhizomucor）等。

參考相關文獻報道分析以上8種優勢真菌菌屬的功能作用如下：

假絲酵母（Candida）屬于半知菌亞門（Deuteromycotina）、芽孢菌綱（Blastomycetes）、隱球酵母目（Cryptococcales）、隱球酵母科（Cryptacoccaceae），此屬中有許多種具有酒精發酵的能力。施安輝等[11]研究發現，徐坊中高溫大曲中耐熱的Candida在酵母菌種中占優勢；呂旭聰等[12]研究發現，福建紅曲黃酒中含有10株光滑假絲酵母（Candida glabrata）。

曲霉屬（Aspergillus）屬半知菌亞門（Deuteromycotina）、絲孢綱（Hyphomycetes）、絲孢目（Hyphomycetes）、從梗孢科（Moniliaceae）[13]，能夠產生淀粉酶、蛋白酶、糖化酶、酯化酶、果膠酶、纖維素酶、單寧酶等，在白酒的釀造過程中主要作用于發酵的前期，是白酒發酵原料中淀粉等大分子物質分解的主要動力之一[14]。

根毛霉屬（Rhizomucor）屬于接合菌門（Zygomycota）、接合菌綱（Zygomycetes）、毛霉目（Mucorales）、毛霉科（Mucoraceae）。高亦豹[15]采用PCR-DGGE技術發現米黑根毛霉（Rhizomucor miehei）僅存在于今世緣中溫曲、口子窖中溫曲、湯溝大曲及劍南春大曲等中溫大曲中。該菌具有很強的產脂肪酶能力，國內外很多學者對該菌所產脂肪酶進行了研究[16]。

嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）屬于真菌門（Eumycota）、子囊菌亞門（Ascomycotina）、嗜熱子囊菌科（Thermoascaceae），可以產生過氧化氫酶[17]、內切葡聚糖酶[18]、木聚糖酶[19]、葡萄糖苷酶[20]、角質酶[21]和幾丁質酶[22]等。徐占成等[8]利用高通量測序法對劍南春大曲真菌群落結構進行分析發現，Thermoascus在檢測大曲樣品中的相對豐度值介于1.711%～5.081%之間。

威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）屬于非釀酒酵母，雖然其發酵能力較低，但其可以合成多種酶，將原料中的前體物質轉化成酯、酸、高級醇和醛等風味物質，對白酒風味的形成有重要的作用[23]。明紅梅等[24]利用響應面法進一步優化異常威克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）發酵產苯乙醇的條件；陳玉香等[25]研究了發酵溫度對W.anomalus產揮發性風味物質的影響。

脈孢菌屬（Neurospora）屬于子囊菌亞門（Ascomycotina）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、糞殼菌目（Sordariales），糞殼菌科（Sordariaceae），主要產生纖維素酶[26]，其模式菌粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）在纖維素降解以及糖轉運蛋白方面取得了極其顯著的成就[27-29]。

炭疽菌屬（Colletotrichum）又稱刺盤孢屬，是半知菌亞門（Deuteromycotina）、腔孢綱（Coelomycetes）、黑盤孢目（Melanconiales）、黑盤孢科（Melanconiaceae）[30]。炭疽菌是一種植物病原真菌[31-32]，也是一種植物內生真菌，普遍存在各種植物中，可以增強植物對病蟲害的抵抗能力或者產生特有的次生代謝產物[33]。

鐮刀菌屬（Fusarium）是全球最重要的大型真菌屬之一，主要侵染農業上重要的谷物[34]，產生的鐮刀菌屬真菌毒素具有急性和慢性毒性作用[35]，在酒曲的生產中要注意防治。

3 結論

本實驗基于Illumina MiSeq高通量測序研究了宋河酒業濃香型白酒中高溫酒曲和芝麻香型白酒高溫酒曲中的真菌群落結構。在屬的分類水平上分析，濃香型白酒中高溫酒曲的優勢真菌群（相對豐度≥1%）主要有假絲酵母（Candida）、嗜熱子囊菌屬（Thermoascus）、根毛霉屬（Rhizomucor）等。芝麻香型白酒高溫酒曲的優勢真菌群主要有假絲酵母（Candida）、曲霉屬（Aspergillus）、威克漢姆酵母（Wickerhamomyces）等。隨著濃香型白酒中高溫酒曲貯存時間的延長，假絲酵母（Candida）的相對豐度逐漸增加，其在兩種酒曲中都是優勢真菌，此屬中有許多種具有酒精發酵的能力。采用高通量測序技術對酒曲中的菌落物種分類研究，操作簡單、通量高、信息豐富，和傳統方法比較具有一定的優越性。該研究成果為進一步研究優化制曲工藝、提高酒曲質量指明了方向，具有重要的理論和實踐意義。