產脂肪酶菌株的篩選、鑒定及發酵培養基優化

賀秋紅，鞏志金，顏 梅

（曲阜師范大學 生命科學學院，山東 曲阜 273100）

脂肪酶（lipase EC3.1.1.3）是一類能催化甘油酯水解的酶的總稱，催化效率高，副產物少，反應條件溫和，不需要輔酶或輔因子的參與，已在合成反應、生物燃料、制藥工業以及洗滌劑、食品、紡織等領域得到廣泛應用。脂肪酶不僅能催化甘油酯類水解與合成，還能催化酯化反應、酯交換反應、醇解反應，促進多肽、表面活性劑和藥物等的合成反應[1]。微生物脂肪酶的研究始于20世紀初，經過100多年的研究，目前已經成為脂肪酶的主要來源。特別是近幾十年來，隨著高效篩選技術和先進基因工程技術的應用，已經實現了曲霉、毛霉和假單胞菌的相對高產，并且部分菌株已經實現工業化應用[2]。我國高質量的脂肪酶產生菌種類少，產量低，很多企業不得不依賴價格昂貴的進口脂肪酶，因此篩選和培育高產優勢脂肪酶產生菌顯得尤為重要[3]。另外，脂肪酶催化的反應類型和條件多種多樣，不同類型的脂肪酶應用方向千差萬別，因此篩選不同來源的脂肪酶是脂肪酶研究的基礎。

微生物脂肪酶的表達主要受環境因子的調節，產脂肪酶微生物需要以油脂和脂肪酸作為碳源生長，因此常用的微生物篩選來源包括油脂加工廠、乳制品工廠以及附近被油脂污染的土壤和水域等[2]。芽孢桿菌是一類潛在的優良脂肪酶生產菌株，目前用于生產脂肪酶的芽孢桿菌有枯草芽孢桿菌[4]、蠟狀芽孢桿菌[5]、類芽孢桿菌[6]和地衣芽孢桿菌[7]等。枯草芽孢桿菌所生產的脂肪酶屬于胞外酶，便于下游分離純化，適用于大規模工業化生產[8-9]，并且普遍具有較高的堿耐受力[10-11]，在洗滌劑和紡織等領域市場需求巨大。本研究從油脂污染水樣中分離出一株產脂肪酶菌株，對其進行形態學特征、生理生化試驗及分子生物學鑒定，并通過單因素試驗和響應面試驗對其發酵培養基組分進行優化，旨在提高脂肪酶產量，進一步對其酶學性質研究提供技術參考和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

從曲阜市多個食堂和食品廠附近被油脂污染的下水道中采集樣品10份。

1.1.2 化學試劑

葡萄糖、酵母膏、磷酸氫二鈉、硫酸銨、氯化鈉、三水磷酸氫二鉀、七水硫酸鎂、瓊脂粉、蛋白胨、橄欖油、羅丹明B、聚乙烯醇（polyvinyl alcohol，PVA）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養基[12-14]

富集培養基：酵母膏0.2 g/L，氯化鈉0.5 g/L，磷酸氫二鈉3.5 g/L，磷酸二氫鉀1.5 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，橄欖油10 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

初篩羅丹明B培養基[14]：硫酸銨0.5 g，氯化鈉4 g，磷酸氫二鉀1 g，七水硫酸鎂0.5 g，瓊脂粉15 g，三丁酸甘油脂乳化液100 mL（4%PVA∶三丁酸甘油脂=3∶1，超聲乳化），用蒸餾水定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min后，待溫度降至60 ℃時加入1 mL羅丹明B 溶液（質量濃度＜10 mg/mL），混勻后倒平板。

初始發酵培養基：葡萄糖5.0 g/L，蛋白陳2 g/L，尿素6.0 g/L，三水磷酸氫二鉀1.0 g/L，硫酸銨1 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，三丁酸甘油脂10.0 mL，用蒸餾水定容至1 000 mL，自然pH，115 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-1D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；SIGMA 2-16PK通用型離心機：德國Sigma公司；TS-1102立式搖床：上海天呈試驗儀器制造有限公司；CL-32L高壓蒸汽滅菌鍋：日本ALP公司；上海申安醫療器械廠；T100型PCR儀、Mini-SubCell核酸電泳儀：美國BioRad公司；CX23生物顯微鏡：日本奧林巴斯有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的篩選

將采集的樣品分別依次進行富集培養、初篩和初始發酵復篩。樣品經過3次富集培養后，分別取50 μL菌液上清涂布于羅丹明B培養基平板，羅丹明B能與脂肪酶降解油脂產生的脂肪酸特異性結合，產酶菌落周圍會生成玫紅色，在波長365 nm紫外燈下呈現橙黃色。將羅丹明B平板放在波長365 nm紫外燈下進行觀察，選取橙黃色圈較大的菌株進行分離培養，鏡檢至無雜菌后作為出發菌種，接種于初始發酵培養基中進行復篩，選出脂肪酶高產菌株[15-17]。

1.3.2 菌種鑒定

根據《常見細菌系統鑒定手冊》[18]，對所篩選的菌株進行形態學特征和生理生化鑒定。提取目的菌株的基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）為模板，以16S rDNA序列的通用引物進行聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增。擴增產物送至上海博尚生物科技有限公司進行測序，并將得到的序列與GenBank數據庫中的序列進行比對分析，使用MEGA-X軟件構建系統發育樹[19]。

1.3.3 產脂肪酶菌株的種子液的制備及發酵培養

種子液的制備：將1.3.1篩選得到的菌種于無菌條件下，接種一環菌至裝液量為50 mL/250 mL的初始發酵培養基中，35 ℃、220 r/min，搖瓶培養12 h，制備成種子液。將種子液按照10%（V/V）裝液量接種至為25 mL/250 mL的發酵培養培養基中，發酵液pH=7，35 ℃、220 r/min條件下搖瓶培養40 h。

1.3.4 發酵培養基組分優化

單因素試驗：設計單因素試驗考察發酵培養基中三丁酸甘油酯添加量（1.2%、1.4%、1.6%、1.8%、2.0%、2.2%、2.4%）、葡萄糖添加量（4 g/L、5 g/L、6 g/L、7 g/L、8 g/L、9 g/L、10 g/L）及尿素添加量（6 g/L、8 g/L、10 g/L、12 g/L、14 g/L、16 g/L、18 g/L）對發酵液中粗脂肪酶活性的影響，確定各因素的中心值及水平。

響應面試驗：根據響應面分析法中Box-Behnken Design（BBD）試驗設計原理，采用上述單因素試驗確定的中心值、低水平和高水平（分別用0、-1、+1表示），以脂肪酶活力（Y）為響應值，對發酵培養基中三丁酸甘油酯添加量（A）、葡萄糖添加量（B）、尿素添加量（C）進行優化，得到最佳發酵條件組合，試驗因素與水平見表1。

表1 發酵條件優化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surfer experiments for fermentation conditions optimization

1.3.5 發酵液中脂肪酶活力的檢測

粗酶液的制備：將發酵液低溫離心去除菌體，4 ℃、5 500 r/min條件下離心15 min，除菌體。上清用0.22 μm濾膜過濾，制成粗酶液于4 ℃保存備用。

脂肪酶活力檢測：參考國標GB/T 23535—2009《脂肪酶制劑》[20]。脂肪酶活力定義：在pH7.5，40 ℃條件下，每分鐘產生1 μmol可滴定脂肪酸所需的酶量為1個酶活力單位（U/mL）。

2 結果與分析

2.1 目的菌株的篩選

經過初篩和富集培養，從10份樣品中篩選分離得到4株橙黃色圈較大的菌株，分別編號為U1、U2、U4、U5，再分別進行搖瓶發酵培養，測定各發酵液中產脂肪酶的活力值，結果見表2。由表2可知，菌株U5脂肪酶酶活最高，為3.3 U/mL，其余3株菌脂肪酶酶活較低，均在1.3～2.9 U/mL范圍內。因此，選擇菌株U5作進一步鑒定。

2.2 菌株U5的鑒定

2.2.1 菌株U5形態學特征

菌株U5的菌落及細胞形態見圖1。由圖1A可知，在瓊脂平板上，菌落乳白色，邊緣不規則，不透明，菌落表面粗糙，略有突起。由圖1B可知，菌體呈圓桿狀，無莢膜，有鞭毛。

圖1 菌株U5的菌落（A）及細胞（B）形態Fig.1 Colony morphology (A) and cell morphology (B) of strain U5

2.2.2 生理生化鑒定

菌株U5能利用甘露醇、檸檬酸鹽、葡萄糖，接觸酶試驗、硝酸鹽還原、V-P試驗、7%氯化鈉生長均為陽性。根據菌株U5的形態特征和生理生化特性，可以初步鑒定菌株為芽孢桿菌屬（Bacillussp.）。

2.2.3 分子生物學鑒定

以菌株U5基因組DNA為模板，采用細菌16S rDNA通用引物進行PCR擴增，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，結果發現擴增條帶約1 500 bp，測序結果見圖2。

圖2 菌株U5 16S rDNA測序結果Fig.2 Sequencing results of 16S rDNA of strain U5

由圖2可知，擴增片段長1 406 bp，符合細菌16S rDNA序列特征。將擴增序列結果同美國國家生物技術信息中心（national center of biotechnology information，NCBI）中的Genbank核酸數據庫進行基本局部比對搜索工具（basic local alignment search tool，BLAST）同源性比對分析，用MEGA-X構建系統發育樹，結果見圖3。

圖3 菌株U5 16S rDNA序列系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of strain U5 based on 16S rDNA sequence

由圖3可知，菌株U5與Bacillus subtilisstrain IAM10（MH815091.1）位于同一族群，親緣關系最近，再結合形態學觀察和生理生化試驗結果，進一步證實菌株U5為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

2.3 發酵培養基組分的優化

2.3.1 單因素試驗結果

分別對發酵組分中三丁酸甘油酯（1.2%～2.4%）、葡萄糖（4～10 g/L）、尿素（6～18 g/L）的添加量進行單因素試驗設計，結果如圖4所示。

由圖4a可知，隨著三丁酸甘油酯添加量的增加，脂肪酶活力呈現先升后降的趨勢，當三丁酸甘油酯添加量為1.8%時，脂肪酶活力最高，達到4.0 U/mL，故將1.8%作為響應面設計中三丁酸甘油酯含量的中心點，中心點左、右兩側等距離的因變量1.6%和2.0%作為低水平和高水平。

由圖4b可知，隨著葡萄糖添加量的增加，脂肪酶活力整體呈現先上升后略微下降的趨勢，當葡萄糖添加量為8 g/L時，脂肪酶活力達到最高；葡萄糖添加量＞8 g/L后略有下降，故葡萄糖含量的中心點設為8 g/L，低水平和高水平分別為7 g/L和9 g/L。

由圖4c可知，隨著尿素添加量的增加，脂肪酶活力呈現先上升后下降的趨勢，當尿素添加量為10 g/L時，脂肪酶活力達到最高，為3.7 U/mL；尿素添加量＞10 g/L脂肪酶活力顯著下降，故將10 g/L作為響應面設計中尿素含量的中心點，中心點左、右兩側等距離的因變量8 g/L和12 g/L作為低水平和高水平。

圖4 三丁酸甘油（a）、葡萄糖（b）及尿素（c）添加量對脂肪酶活力的影響Fig.4 Effects of tributyrin (a),glucose (b) and urea (c) addition on lipase activity

2.3.2 Box-Behnken Design試驗結果

根據單因素確定的中心點和因素水平，運用DesignExpert 8.0.5b中BBD試驗設計原理進行3因素3水平的響應面試驗設計，試驗設計方案和結果見表3，方差分析見表4。對表3中進行多元回歸擬合，建立二階回歸模型，找到最優響應因子水平，多元二次回歸方程如下所示：

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Design and results of Box-Behnken experiments

由模型的回歸結果分析和方程方差分析可知，該二次模型顯著（P=0.000 9＜0.05），失擬項不顯著（P=0.495 7＞0.05），決定系數R2=0.950 1，說明有95.01%的變差能夠由該模型解釋；變異系數為2.21%，說明變異（偏離）程度較小。由圖5可知，各因素間有一定的交互作用，最佳預測點在試驗考查范圍內。因此，該二階歸模型具有良好的擬合度，能真實地描述各因素與響應值之間的關系，可對菌株U5發酵產脂肪酶條件進行預測和分析。一次項A、B，交互項AC，二次項B2對結果影響極顯著（P＜0.01）。

表4 響應面試驗回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of response surface experiments

由回歸方程預測得到三丁酸甘油脂添加量為2.00%，葡萄糖添加量為8.84 g/L，尿素添加量為8.00 g/L，發酵獲得粗脂肪酶活力預測值為4.36 U/mL。為方便實際培養基配制，選取三丁酸甘油脂添加量為2%，葡萄糖添加量為9 g/L，尿素添加量為8 g/L。在此優化培養基條件下，發酵獲得粗脂肪酶活力實際值為4.30 U/mL，與預測值基本接近，說明所建模型擬合良好且可靠。因此通過響應面優化后得到的最佳發酵培養基配方為三丁酸甘油脂2%，葡萄糖9 g/L，尿素8 g/L，蛋白陳2 g，K2HPO4·3H2O 1.0 g/L，（NH4）2SO41.0 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L；發酵條件為接種量10%，初始pH值=7，溫度35 ℃，轉速220 r/min，搖瓶培養40 h。

圖5 三丁酸甘油脂、葡萄糖及尿素添加量對發酵產脂肪酶活力影響的響應面及等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction of between tributyrin,glucose and urea addition on lipase activity

2.4 模型驗證及分析

為檢驗模型可靠性和有效性，分別用模型預測的最優培養基配方和原始培養基配方進行搖瓶發酵，每組試驗設置3個平行，檢測不同取樣時間時的脂肪酶活力，結果見圖6。由圖6可知，脂肪酶活力最高為4.3 U/mL，比未優化前的活力3.7 U/mL提高16.22%。模型的預測值與實際發酵結果十分接近說明模型預測性良好。

圖6 培養基組分優化前后脂肪酶活力的變化Fig.6 Changes of lipase activity before and after culture medium optimization

3 結論

研究從富油水樣中篩選出一株脂肪酶產生菌株U5，經形態觀察、生理生化試驗及16SrDNA序列分析鑒定其為枯草芽孢桿菌（Bacillussubtilis），利用單因素及響應面試驗優化，得到菌株U5發酵產脂肪酶的培養基中最佳配方為三丁酸甘油2%，葡萄糖9 g/L，尿素8 g/L，在此培養基組分下所產脂肪酶活力為4.3 U/mL，比未優化前的酶活力提高16.22%，研究可繼續對U5芽孢桿菌發酵產脂肪酶的菌種進行工程化改造、發酵過程控制優化、發酵罐放大試驗等方面做進一步探索，逐步提高芽孢桿菌U5產脂肪酶的能力和活力。