低溫等離子體及防腐劑對解淀粉芽孢桿菌芽孢滅活效果的影響

譚秀山，趙 興，黃現青

（1.新疆職業大學 烹飪與餐飲管理學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.新疆科技項目服務中心，新疆 烏魯木齊 830011；3.河南農業大學 食品科學技術學院 河南省食品加工與流通安全控制工程技術研究中心，河南 鄭州 450002）

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）屬于兼性厭氧型革蘭氏染色呈陽性的芽孢桿菌，與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）親緣性相近，大部分分離來自土壤和植物，也有少部分從畜禽體內分離獲得[1]。由于芽孢桿菌在熱殺菌下等不利條件下易形成芽孢，而芽孢對熱、干燥、輻射、化學消毒劑和其他理化因素有較強的抵抗力，且大部分芽孢桿菌能產生毒素，對食品安全產生威脅。而解淀粉芽孢桿菌作為少數無毒的芽孢桿菌之一，研究殺菌方式對其芽孢的影響可為控制其他芽孢桿菌提供借鑒。

乳酸鏈球菌素（Nisin）、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉均是食品中常見的防腐劑，但抑菌機理和應用范圍有所不同，對于一般微生物防腐劑的復配更能起到協同殺菌效應[2]。研究表明，乳酸鏈球菌素對枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）和巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）有抑制作用，而山梨酸鉀對它們無抑制作用[1，3]。王征征等[4]研究表明，脫氫乙酸鈉對蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、產硫芽孢桿菌（Bacillus sulfordii）、球形賴氨酸芽孢桿菌（Lysinibacillus sphaericus）有明顯抑制作用。由于解淀粉芽孢桿菌非致腐、非致病性微生物，因此，很少見關于防腐劑或其他方式殺滅、抑制解淀粉芽孢桿菌芽孢作用效果研究。

20世紀60年代，開始了等離子體（plasma）被用于滅菌的研究[5]。隨后，有關低溫等離子體（low-temperature plasma）對微生物的殺滅作用的研究報道迅速增加。等離子體是指氣體在加熱或者強電磁場作用下產生的高度電離的氣體云，其所含的活性自由基及射線對微生物有較好的殺滅作用[6-7]，由于產生等離子體的方式不同，所以對微生物的殺滅機制也不同。傳統的產生等離子體的方式有兩種：一是大氣壓下的高電壓氣體擊穿電離（幾千伏到上萬伏），如相對低溫的介質阻擋放電（dielectric barrier discharge，DBD）技術，二是真空室中的低溫大面積放電[8]。目前，國內外眾多研究證明，低溫等離子體對細菌繁殖體[9-10]、真菌[11-12]、病毒[13]等都具有良好的殺滅效果。然而不同方法（激發源、基礎氣體、放電方法等因素）產生的低溫等離子體成分不同，同種成分的濃度也可能不同，殺菌效果就會有差別[14-15]。

鑒于解淀粉芽孢桿菌芽孢對食品安全的威脅，本實驗選用乳酸鏈球菌素、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉防腐劑，考察其對解淀粉芽孢桿菌芽孢的抑菌效果，并對防腐劑的最佳配比進行優化；以高壓電源為激發源，以空氣為基礎氣體，以介質阻擋放電技術產生大氣壓低溫等離子體[16]，研究其對解淀粉芽孢桿菌芽孢的滅活效果。從而為控制解淀粉芽孢桿菌及其芽孢在殺菌食品中的殘留提供理論及應用指導，為進一步確保食品微生物安全提供技術保障。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）：某食品公司技術研究中心提供。

1.1.2 化學試劑

番紅花紅T：天津市致遠化學試劑有限公司；孔雀石綠：天津市永大化學試劑有限公司；磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution，PBS）（pH7.2～7.4）：北京索萊寶科技有限公司；酵母浸粉、蛋白胨（均為生化試劑）、氯化鈉（分析純）：北京奧博星生物技術有限責任公司；山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉（均為分析純）、乳酸鏈球菌素（效價940 IU/mg）：雙匯食品有限公司技術研究中心。

1.1.3 培養基

LB液體培養基、營養瓊脂（nutrient agar，NA）培養基、平板計數瓊脂（plate count agar，PCA）培養基：北京奧博星生物技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

FA224電子分析天平：上海舜宇恒平科學儀器有限公司；1379Ⅱ級A2型生物安全柜：賽默飛世爾（蘇州）儀器有限公司；XH-T渦旋混合器：江蘇金怡儀器有限公司；FXB303-2電熱恒溫培養箱：上海樹立儀器儀表有限公司；THZ-C臺式恒溫振蕩器：太倉市華美生化儀器廠；SX-500全自動蒸汽滅菌器：北京五洲東方科技發展有限公司；SY-DT02低溫等離子體處理儀：蘇州市奧普斯等離子體科技有限公司；DHG-9143BS電熱恒溫鼓風干燥箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；BM1000生物顯微鏡：南京江南永新光學有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 解淀粉芽孢桿菌芽孢菌懸液的制備

將活化的解淀粉芽孢桿菌接入含LB液體培養基的錐形瓶，搖勻，放進臺式恒溫振蕩培養箱里，37 ℃、150 r/min條件下振蕩培養過夜至對數生長期。移取上述菌液200 μL接種到含有0.001%氯化錳的營養瓊脂平板上，37 ℃培養5 d后室溫放置1～3 d，然后挑取培養基上單個典型菌落，涂片固定，并以5%孔雀石綠溶液和0.5%番紅花紅T法染色，并在顯微鏡下進行鏡檢，當芽孢形成率＞95%時為合格，鏡檢合格后用無菌0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）洗下，轉入含有無菌玻璃珠錐形瓶內振搖5 min，接著將錐形瓶放入90 ℃水浴30 min使菌自溶斷鏈，形成均勻的芽孢懸液后離心（5 000 r/min、15 min）取沉淀物，用無菌磷酸鹽緩沖液（pH=7.2）重懸3次，采用平板記數法測得芽孢懸液的濃度約為2.34×105CFU/mL，制得的芽孢菌懸液置4 ℃冰箱備用，使用前（90 ℃、30 min）滅活繁殖體并進行適度稀釋[17]。

1.3.2 單一防腐劑對解淀粉芽孢桿菌芽孢滅活效果

脫氫乙酸鈉：制備含脫氫乙酸鈉質量濃度為1～10 mg/mL（濃度梯度為1 mg/mL）的平板計數瓊脂培養基，吸取100 μL的芽孢菌懸液到計數培養基表面，并涂布，于37 ℃靜置培養24 h，考察不同濃度脫氫乙酸鈉對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的影響。

山梨酸鉀：制備含山梨酸鉀質量濃度為1～10 mg/mL（濃度梯度為1 mg/mL）的平板計數瓊脂培養基，吸取100 μL的芽孢菌懸液到計數培養基表面，并涂布，于37 ℃靜置培養24 h，考察不同濃度山梨酸鉀對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的影響。

乳酸鏈球菌素：制備含乳酸鏈球菌素質量濃度為1～10 mg/mL（濃度梯度為1 mg/mL）的平板計數瓊脂培養基，吸取100 μL的芽孢菌懸液到計數培養基表面，并涂布，于37 ℃靜置培養24 h，考察不同濃度乳酸鏈球菌素對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的影響。

1.3.3 復合防腐劑對解淀粉芽孢桿菌芽孢滅活效果

分別制備含脫氫乙酸鈉∶乳酸鏈球菌素=1∶1、山梨酸鉀∶乳酸鏈球菌素=2∶1、山梨酸鉀∶脫氫乙酸鈉=2∶1、脫氫乙酸鈉∶山梨酸鉀∶乳酸鏈球菌素=1∶2∶1的菌落計數平板，移取100 μL芽孢懸液，然后用無菌涂布棒涂布均勻，同時向空白計數平板只涂100 μL稀釋濃度相同的芽孢懸液作為空白對照，最后在37 ℃條件下恒溫培養24 h后計數。

1.3.4 低溫等離子體對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的影響

用無菌生理鹽水將芽孢懸液稀釋為300 CFU/mL，振蕩均勻，并標記好處理的電源功率（300～500 W）與時間（50～500 s）。經低溫等離子體處理后，取100 μL菌懸液涂布平板計數，依次用同樣的方法進行其他處理，同時做好空白對照組，然后將平板于37 ℃條件下恒溫培養24 h后計數。

1.3.5 分析檢測

把培養24 h的平板計數瓊脂培養基從培養箱中取出，對平板計數瓊脂培養基上長出的菌落數進行計數，并標記出平板上菌落個數，記錄實驗數據[18]。解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率計算公式如下[19]：

1.3.6 數據分析

利用SPSS13.0軟件對數據作單因素方差分析。

2 結果與分析

2.1 解淀粉芽孢桿菌菌落及芽孢形態觀察

把培養好的解淀粉芽孢桿菌單個菌落培養挑起，在顯微鏡下鏡檢，結果見圖1。由圖1A可知，解淀粉芽孢桿菌菌落呈淡黃色不透明菌落，表面粗糙，有隆起，邊緣不規則；由圖1B可知，解淀粉芽孢桿菌芽孢呈橢圓形，兩端鈍圓，芽孢囊不膨大，中生到次端生，可以看到菌落中芽孢率達到95%以上。

圖1 解淀粉芽孢桿菌的菌體（A）及芽孢（B）形態Fig.1 Cell (A) and spore (B) morphology of Bacillus amyloliquefaciens

2.2 單一防腐劑對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的影響

3種防腐劑在不同濃度的條件下對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的影響結果見表1。

表1 單一防腐劑對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的影響Table 1 Effects of single preservative on the lethallty rate of Bacillus amylopolyticus spores %

由表1可知，山梨酸鉀對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的變化差異較大，波動性較為明顯，在最大質量濃度為10 mg/mL時，對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率僅為46%。而脫氫乙酸鈉、乳酸鏈球菌素濃度分別為4 mg/mL、5 mg/mL時，其對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率已達95%以上。結果表明，3種防腐劑中，抑制效果由大到小順序為脫氫乙酸鈉＞乳酸鏈球菌素＞山梨酸鉀。

2.3 復合防腐劑對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的影響

按照不同配比，分析三種防腐劑復配對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的影響，結果見表2。由表2可知，脫氫乙酸鈉與Nisin（1∶1）、Nisin∶山梨酸鉀（1∶2）及脫氫乙酸鈉∶山梨酸鉀（1∶2）復配防腐劑對解淀粉芽孢桿菌芽孢抑制效果較好，二者質量濃度分別為0.5 mg/mL、0.8 mg/mL、0.8 mg/mL時，芽孢抑制率可達90%以上；脫氫乙酸鈉∶山梨酸鉀∶Nisin配比為1∶2∶1、質量濃度為0.5 mg/mL時，芽孢抑制率可達90%以上。

表2 復合防腐劑對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的影響Table 2 Effects of compound preservatives on lethallty rate of Bacillus amylopolyticus spores %

2.4 低溫等離子體對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的影響

低溫等離子體對解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率的影響結果見表3。

表3 低溫等離子體對解淀粉芽孢桿菌芽孢的致死率的影響Table 3 Effects of low temperature plasma on lethallty rate of Bacillus amylolyticus spores %

由表3可知，處理時間為50 s，功率為300 W時，解淀粉芽孢桿菌芽孢致死率為75%，隨著處理時間的延長到150 s，其作用效果逐漸變差，進一步延長處理時間達200 s以上后，甚至顯示對芽孢的萌發及存活具有較好的促進效應，明顯和對營養體的作用效果不同[6-7，13]，關于其原因尚待進一步研究解釋。而400 W、500 W條件下不同處理時間對解淀粉芽孢桿菌芽孢的致死率的影響和300 W具有一定的相似性。結果表明，低溫等離子體在低強度處理時，不宜處理較長時間。

3 結論

本實驗以解淀粉芽孢桿菌芽孢為研究對象，通過山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉、乳酸鏈球菌素3種防腐劑的單一與復配，以及低溫等離子體對芽孢的處理，研究其對解淀粉芽孢桿菌芽孢抑制的影響。結果表明，單一添加防腐劑時，3種防腐劑中脫氫乙酸鈉對該芽孢抑制效果最佳，在4 mg/mL時抑制效果可達97%；乳酸鏈球菌素次之，山梨酸鉀抑制效果最差。防腐劑復配時，脫氫乙酸鈉∶乳酸鏈球菌素（1∶1）、脫氫乙酸鈉∶山梨酸鉀∶Nisin（1∶2∶1）復合防腐劑抑制效果較好，質量濃度為0.5 mg/mL時可達90%以上。使用低溫等離子體處理芽孢時，參數設置為50 s、300 W或500 W時效果最佳，芽孢抑制率達到75%。