硫化氫可通過(guò)改善肺動(dòng)脈內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化減輕野百合堿誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓

張 卉， 藺艷軍， 毛承譽(yù)， 潘建安， 張繪莉

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院心內(nèi)科，上海 200001

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary artery hypertension，PAH)是一種由多種病因引起的以肺動(dòng)脈血管壓力持續(xù)升高及肺血管重構(gòu)為特征的慢性進(jìn)行性疾病。這種疾病嚴(yán)重限制了右心室的功能，并導(dǎo)致右心功能衰竭，甚至死亡[1]。內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT)是一種復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程，即內(nèi)皮細(xì)胞失去內(nèi)皮細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)，呈現(xiàn)典型的間充質(zhì)細(xì)胞形態(tài)和功能，獲得細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性和收縮性[2]。EndMT不僅參與胚胎發(fā)育過(guò)程，還與炎癥、纖維化、PAH等疾病密切相關(guān)[3-7]。

硫化氫(hydrogen sulfide，H2S)是繼一氧化氮和一氧化碳之后的第3種細(xì)胞內(nèi)氣體信號(hào)分子，通過(guò)蛋白質(zhì)過(guò)硫化物的形成或蛋白質(zhì)硫化水解參與多種生理和病理過(guò)程[8-9]。H2S參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和氧化應(yīng)激，在心血管系統(tǒng)中具有重要的生理作用[10-13]。研究[14-15]表明，H2S可減輕肺血管重構(gòu)和PAH。然而，H2S與PAH中EndMT之間的關(guān)系鮮有報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)大鼠PAH模型和細(xì)胞研究，探討H2S能否調(diào)控肺動(dòng)脈EndMT過(guò)程，及其與H2S抗PAH作用之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 40只SPF級(jí)雄性SD大鼠，10周齡，體質(zhì)量(250±15) g，由上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動(dòng)物房提供。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、硫氫化鈉(NaHS)組和炔丙基甘氨(PAG，H2S合成抑制劑)組，每組10只。除對(duì)照組給予0.9%氯化鈉溶液注射外，其他3組動(dòng)物一次性腹腔注射MCT 60 mg/kg制備PAH模型，注射7 d后分別腹腔注射等體積0.9%氯化鈉溶液、NaHS 1 mg·kg-1·d-1、PAG 10 mg·kg-1·d-1。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞(HPAECs)購(gòu)自ScienCell公司。細(xì)胞在含有5%的胎牛血清(FBS)、100 U/mL的青霉素、100 μg/mL的鏈霉素和1%內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(ECM)中培養(yǎng)，在干預(yù)24 h前接種于6孔板中。干預(yù)前，用無(wú)血清培養(yǎng)基沖洗細(xì)胞2次，將細(xì)胞分別予以0.9%氯化鈉溶液或硫氫化鈉NaHS 50、100、200 μmol/L預(yù)處理2 h；以轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF- β1)10 ng/mL分別刺激1 h、3 d、10 d，收獲細(xì)胞。分別觀察Snail、血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)水平和細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.3 大鼠血流動(dòng)力學(xué)和右心室肥厚指標(biāo)測(cè)定 大鼠經(jīng)腹腔注射4%水合氯醛0.9 mL/kg麻醉后[14]，暴露右側(cè)頸外靜脈并將PE導(dǎo)管引導(dǎo)通過(guò)上腔靜脈、右心房、右心室進(jìn)入肺動(dòng)脈。通過(guò)BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，將導(dǎo)管體外末端連接到壓力傳感器以記錄肺動(dòng)脈壓的連續(xù)變化，包括收縮期肺動(dòng)脈壓(PASP)、舒張期肺動(dòng)脈壓(PDSP)和平均肺動(dòng)脈壓(mPAP)。處死大鼠后，分離和洗滌大鼠心臟，沿房室溝銳性剪掉左右心房組織，分別剪取右心室游離壁(RV)及左心室+室間隔(LV+S)，用濾紙吸去心室表面血液后稱質(zhì)量，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)(right ventricular hypertrophy index，RVHI)。RVHI=RV/(LV+S)，RVHI>0.33時(shí)表示右心室肥大。

1.4 蘇木精-伊紅(H-E)染色觀察大鼠肺血管結(jié)構(gòu)變化 將大鼠肺組織于4%多聚甲醛中固定后，石蠟包埋切片(5 μm)，脫蠟和水化后行H-E染色。在光學(xué)顯微鏡(200倍和400倍)下觀察血管外徑為50～100 μm的小血管。采用Image J圖像分析軟件測(cè)量肺小動(dòng)脈管壁厚度。

1.5 免疫印跡檢測(cè)蛋白的表達(dá) 將稱重后的肺組織或消化后的細(xì)胞加入到細(xì)胞裂解液中充分勻漿后，于4℃裂解30 min，然后在4℃、12 000 r/min條件下離心15 min，獲得澄清的組織勻漿或細(xì)胞裂解物。通過(guò)蛋白質(zhì)定量(BCA)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。用SDS-PAGE凝膠對(duì)蛋白質(zhì)(20 μg)進(jìn)行分離后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，用5%脫脂牛奶將膜封閉2 h。然后，在4℃下用一抗孵育過(guò)夜：VE-Cadherin兔多克隆抗體(1∶1 000，Abcam公司)，α-SMA小鼠單克隆抗體(1∶1 000，Abcam公司)，Snail兔單克隆抗體(1∶1 000，CST公司)，β-actin兔多克隆抗體(1∶1 000，Abcam公司)。次日，回收一抗后將膜在TBST中充分洗滌，用抗兔IgG(1∶10 000，CST公司)和抗小鼠IgG(1∶10 000，CST公司)避光孵育1 h。回收二抗后用TBST充分洗滌，在Odyssey雙色紅外激光成像系統(tǒng)中顯影，對(duì)條帶灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 免疫熒光檢測(cè)蛋白的表達(dá) 將肺組織石蠟切片放入60℃烘箱內(nèi)烘烤20 min，二甲苯脫蠟后用檸檬酸鈉抗原修復(fù)液(pH 6.0)修復(fù)抗原。將切片放置于濕盒中,用5%山羊血清于37℃封閉1 h，去除封閉液，滴加VE- cadherin兔多克隆抗體(1∶100)和α-SMA小鼠單克隆抗體(1∶100)在4℃下孵育過(guò)夜。次日，將復(fù)溫的切片用PBS漂洗3次后，用抗兔IgG(1∶1 000，CST公司)和抗小鼠IgG(1∶1 000，CST公司)在37℃下避光孵育1 h。用Hoechst染細(xì)胞核3 min，滴加抗熒光淬滅劑封片。在光學(xué)顯微鏡(400倍)下觀察，并通過(guò)Fluoview程序拍照。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠體質(zhì)量、肺動(dòng)脈壓力、右心室肥厚情況 MCT注射21 d后，對(duì)照組大鼠無(wú)死亡，模型組死亡3只，NaHS組死亡1只，PAG組死亡4只。結(jié)果(表1)顯示：與對(duì)照組相比，模型組大鼠體質(zhì)量減小，mPAP、PASP升高，RVHI增加(P<0.05)，證明PAH模型構(gòu)建成功。與模型組相比，NaHS組大鼠體質(zhì)量增加，mPAP、PASP降低，RVHI減小(P<0.05)；PAG組體質(zhì)量進(jìn)一步減小，mPAP、PASP進(jìn)一步升高、RVHI進(jìn)一步增加(P<0.05)。

表1 各組PAH大鼠體質(zhì)量、mPAP、PASP、RVHI比較

PAH：肺動(dòng)脈高壓；NaHS：硫氫化鈉；PAG：炔丙基甘氨；mPAP：平均肺動(dòng)脈壓；PASP：肺動(dòng)脈收縮壓；RVHI：右心室肥厚指數(shù).*P<0.05與對(duì)照組比較；#P<0.05與模型組比較

2.2 大鼠肺小血管形態(tài)學(xué)變化 大鼠肺組織H-E染色結(jié)果(圖1)顯示：對(duì)照組肺小動(dòng)脈管壁較薄，血管結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)皮細(xì)胞分布均勻，外膜無(wú)明顯血管外基質(zhì)沉積；模型組肺小動(dòng)脈管壁增厚明顯(P<0.05)，管腔狹窄，血管中膜增生明顯，周圍組織炎性浸潤(rùn)；NaHS組肺小動(dòng)脈管壁增厚明顯減輕(P<0.05)，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；PAG組肺小動(dòng)脈管腔接近閉塞(P<0.05)，血管壁失去正常結(jié)構(gòu)。

圖1 硫化氫對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺組織的影響

2.3 大鼠EndMT情況 免疫印跡結(jié)果(圖2)顯示：與對(duì)照組相比，模型組Snail和α-SMA表達(dá)增加，VE-cadherin表達(dá)減少(P<0.05)。與模型組相比，NaHS組Snail和α-SMA表達(dá)減少，VE-cadherin表達(dá)增加(P<0.05)；PAG組Snail和α-SMA表達(dá)進(jìn)一步增加，VE-cadherin表達(dá)進(jìn)一步減少(P<0.05)。

免疫熒光結(jié)果(圖3)顯示：與對(duì)照組相比，模型組VE-cadherin表達(dá)減少，α-SMA表達(dá)增加。與模型組相比，NaHS組VE-cadherin表達(dá)增加，α-SMA表達(dá)減少；PAG組VE-cadherin表達(dá)進(jìn)一步減少，α-SMA表達(dá)進(jìn)一步增加。

圖2 免疫印跡檢測(cè)硫化氫對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠EndMT的影響

A：VE-cadherin和α-SMA；B：Snail；C：相對(duì)表達(dá)量比較.*P<0.05與對(duì)照組比較；#P<0.05與模型組比較

圖3 免疫熒光檢測(cè)硫化氫對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠肺小血管EndMT的影響

2.4 HPAECs形態(tài)學(xué)變化 對(duì)HPAECs予以TGF-β1刺激10 d后，于倒置顯微鏡100倍視野下觀察細(xì)胞形態(tài)，結(jié)果(圖4)顯示：對(duì)照組細(xì)胞排列規(guī)則，相互融合，細(xì)胞核呈卵圓形，以典型的“鵝卵石”樣生長(zhǎng)；TGF-β1組細(xì)胞呈梭形生長(zhǎng)，細(xì)胞間分界明顯，呈現(xiàn)出平滑肌樣細(xì)胞特征；NaHS預(yù)處理后，梭形細(xì)胞明顯減少(P<0.05)，細(xì)胞形態(tài)介于前2組之間。

2.5 HPAECs的EndMT情況 結(jié)果(圖5)顯示：TGF-β1誘導(dǎo)后，HPAECs中Snail、α-SMA表達(dá)增加，VE-cadherin表達(dá)減少(P<0.05)。NaSH預(yù)處理可劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)這一變化，即Snail、α-SMA表達(dá)減少，VE-cadherin表達(dá)增加(P<0.05)。

圖4 硫化氫對(duì)TGF- β1誘導(dǎo)的HPAECs形態(tài)學(xué)變化

A：TGF- β1誘導(dǎo)10 d后形態(tài)學(xué)變化；B：TGF- β1誘導(dǎo)10 d后，梭形細(xì)胞比例比較.*P<0.05與對(duì)照組比較；#P<0.05與TGF- β1組比較

圖5 免疫印跡檢測(cè)硫化氫對(duì)TGF- β1誘導(dǎo)的HPAECs EndMT的影響

A：TGF- β1誘導(dǎo)3 d后VE-cadherin和α-SMA相對(duì)表達(dá)量；B：TGF- β1誘導(dǎo)1 d后Snail相對(duì)表達(dá)量；C：蛋白相對(duì)表達(dá)量統(tǒng)計(jì)學(xué)比較.*P<0.05與對(duì)照組比較；#P<0.05與模型組比較

3 討 論

內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生EndMT的特征性變化主要表現(xiàn)為α-SMA增加、波形蛋白磷酸化及VE-cadherin的減少。EndMT已被證實(shí)存在于PAH患者，也可見(jiàn)于MCT誘導(dǎo)、MCT聯(lián)合缺氧和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體阻滯誘導(dǎo)的PAH動(dòng)物模型中。EndMT主要表現(xiàn)為內(nèi)皮細(xì)胞遷移至內(nèi)皮下間質(zhì)，Twist-1表達(dá)增加，由p120連環(huán)蛋白和VE-cadherin介導(dǎo)的細(xì)胞黏附喪失[2-3, 6]。本研究進(jìn)一步驗(yàn)證了這些表型變化。

在心血管系統(tǒng)中，H2S主要由胱硫醚-γ-裂解酶(cystathionine-γ-lyase, CSE)產(chǎn)生，能通過(guò)擴(kuò)張血管維持心血管穩(wěn)態(tài)，在抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖和預(yù)防膠原重塑方面具有重要作用[15-16]。本課題組研究[17]已證明，給予NaHS (1 mg·kg-1·d-1)可以促進(jìn)小鼠內(nèi)皮細(xì)胞血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)的表達(dá)和血管緊張素1-7(Ang 1-7)的產(chǎn)生，進(jìn)而減輕小鼠動(dòng)脈粥樣硬化。H2S的異常產(chǎn)生和功能障礙是幾種重要心血管疾病發(fā)展的關(guān)鍵因素，例如原發(fā)性高血壓、PAH、動(dòng)脈粥樣硬化、血管鈣化和心臟肥大。

既往研究[18-20]已證實(shí)，H2S可以通過(guò)舒張平滑肌、抑制內(nèi)皮素誘導(dǎo)的平滑肌細(xì)胞增殖或降低肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞炎癥水平來(lái)減輕大鼠PAH。但是，H2S是否通過(guò)調(diào)節(jié)EndMT來(lái)調(diào)控肺血管重構(gòu)及PAH的進(jìn)程，目前尚不清楚。本研究表明，外源性給予H2S供體(NaHS)顯著逆轉(zhuǎn)了EndMT過(guò)程，即NaHS部分改善了內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin的缺失和α-SMA的增加。由于手術(shù)時(shí)間不長(zhǎng)，本研究在水合氯醛麻醉下[14]，短時(shí)間內(nèi)經(jīng)右心導(dǎo)管檢測(cè)肺動(dòng)脈壓力，發(fā)現(xiàn)NaHS減輕了PAH程度；采用PAG抑制內(nèi)源性H2S的合成后，則進(jìn)一步促進(jìn)了EndMT的發(fā)生，加劇了肺血管重構(gòu)及PAH進(jìn)程。本研究結(jié)果表明，H2S可能通過(guò)抑制EndMT，在MCT誘導(dǎo)的PAH中對(duì)肺組織發(fā)揮一定的保護(hù)作用。

TGF-β1是具有多種功能的細(xì)胞因子。有研究[21-22]表明，其參與血管內(nèi)皮細(xì)胞EndMT過(guò)程。本研究應(yīng)用TGF-β1刺激HPAECs 后3 d獲得明顯的EndMT，予以NaHS預(yù)處理后，內(nèi)皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)變被逆轉(zhuǎn)，與在MCT誘導(dǎo)的大鼠模型中的發(fā)現(xiàn)一致。

Snail是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族，通過(guò)抑制鈣黏蛋白的表達(dá)來(lái)促進(jìn)EndMT[23]。因此，本研究還檢測(cè)了Snail表達(dá)水平的變化。動(dòng)物模型的研究結(jié)果表明，模型組Snail表達(dá)增加，而NaHS干預(yù)后，Snail表達(dá)減少；與之相反，用PAG抑制內(nèi)源性H2S后，則進(jìn)一步刺激了Snail的表達(dá)。體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此結(jié)果一致。本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，H2S可通過(guò)抑制Snail的激活，影響PAH肺組織中EndMT現(xiàn)象。

此外，H2S還可能通過(guò)其他機(jī)制影響EndMT或上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)。有研究[24]表明，在腎小管上皮細(xì)胞中，H2S可通過(guò)抑制TGF-β1誘導(dǎo)的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)和Wnt/β-連環(huán)蛋白(β- catenin)通路的轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕TGF-β1誘導(dǎo)的EMT。Ying等發(fā)現(xiàn)，H2S可以通過(guò)Src途徑預(yù)防內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的EndMT[25]。此外，也有研究[26-28]發(fā)現(xiàn)，H2S可能通過(guò)Smad、Scr和p38途徑抑制EndMT。

綜上所述，本研究證實(shí)，H2S能減輕MCT誘導(dǎo)的大鼠PAH，此作用可能與其改善肺組織EndMT的作用有關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，H2S作為一種新型氣體信號(hào)分子，在EndMT中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。H2S在PAH、纖維化、傷口修復(fù)、炎癥和惡性腫瘤中可能具有潛在的應(yīng)用前景，值得進(jìn)一步研究。