靜脈高壓導致的剪應力改變在載脂蛋白A-1結合蛋白調控血管內皮生長因子表達中的作用

李嘉楠， 馮明陶， 李 強， 許 奕， 張 琪， 劉建民

海軍軍醫大學長海醫院神經外科，上海 200433

靜脈高壓已為誘發硬腦膜動靜脈瘺(dural arteriovenous fistula, DAVF)發生發展的主要原因，但靜脈高壓通過何種發病機制發揮作用仍不確定。目前的研究[1-2]認為，靜脈端壓力升高造成低灌注和靜脈剪應力的改變，進而使血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達上調，是促使硬膜血管新生的重要機制。血管內皮細胞可將剪應力等機械性刺激信號轉化為細胞內的化學信號，但其機制尚不明確。

膽固醇代謝在維持細胞正常結構和功能中發揮著至關重要的作用，然而關于其調控血管新生的機制仍不明確。Kwon等[3]在1998年在高膽固醇豬模型中發現，膽固醇增加可使動脈血管滋養血管網密度增加，提示膽固醇代謝紊亂可能與血管新生相關。但是，動脈粥樣硬化斑塊中，膽固醇代謝紊亂通過何種機制啟動血管新生目前暫不明確。

載脂蛋白A-1結合蛋白(apoA-I binding protein，AIBP)是最早由Ritter等通過酵母雙雜交技術從人肝臟cDNA文庫中篩選出來的分泌蛋白，其編碼基因為APOA1BP，位于1號染色體長臂21區[4-5]。Fang等[6]發現，AIBP在膽固醇代謝調控血管新生的過程中起關鍵作用。AIBP協同高密度脂蛋白調控膽固醇流出，進而通過改變細胞膜上的脂筏結構，抑制VEGF受體與脂筏中的小窩蛋白共定位，阻斷VEGF信號通路，起到抑制血管新生的作用。因此，本研究通過大鼠靜脈高壓模型及體外實驗探討AIBP在剪應力導致的血管新生中發揮的作用及其機制，以期為DAVF的臨床治療提供參考標靶。

1 材料與方法

1.1 動物及模型的建立 清潔級雄性SD大鼠80只，體質量200～220 g ，購自海軍醫學研究所，將SD大鼠置于小動物麻醉誘導箱，行5%異氟烷麻醉誘導，誘導完成后，行2%異氟烷面罩吸入維持麻醉狀態。將大鼠隨機均分為4組(每組20只)：A組大鼠行右側頸動脈-頸外靜脈吻合術+左側橫竇閉塞術+頂骨磨除術；B組大鼠行右側頸動脈-頸外靜脈吻合術+頂骨磨除術；C組大鼠行右側頸動脈結扎術+右側頸外靜脈結扎術+頂骨磨除術；D組大鼠行頂骨磨除術。

1.2 細胞及試劑 人臍靜脈內皮細胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)株購自中國科學院上海分院。胰蛋白酶、青霉素G鈉鹽、硫酸鏈霉素購自美國AMRESCO公司；高糖DMEM培養液購自美國Gibco公司；OBS鹽酸緩沖溶液購自上海索萊寶科技有限公司；標準胎牛血清購自深圳市賽亞生物技術有限公司。VEGF、AIBP單克隆抗體及辣根過氧化物酶標記的二抗均購自美國Abcam公司；VEGF、AIBP酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自武漢Elabscience公司；總膽固醇測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 HUVEC爬片制備及培養 將3片載玻片(2.5 cm×7.5 cm×1 mm)置于10 cm×10 cm培養皿中，用水浴融化的1%明膠溶液包備備用。HUVEC置于37℃、5%CO2條件傳代培養，消化后將細胞懸液移至50 mL離心管中，將細胞密度調至8×106后，充分吹打為單細胞懸液后，接種于鋪好載玻片的方形培養皿中，繼續于孵箱中培養24～48 h。將細胞恒切應力流動態培養儀置于超凈臺并連接好；加30 mL配制好的高糖DMEM培養液于蓄液瓶中，將其置于37℃、5%CO2孵箱。將孵箱外管道連接到恒剪應力驅動原上，排除管道內剩余氣體。在超凈臺內將準備好的細胞爬片置于培養腔中，培養腔移入孵箱內，連接于平波器與蓄液瓶之間。將剪應力驅動原連接至計算機，啟動程序。恒剪應力下培養HUVEC 24 h。

1.4 上矢狀竇剪應力測定 SD大鼠術后常規飼養3個月后，經5%異氟烷誘導麻醉，取俯臥位。用彩色多普勒超聲探測儀(探頭頻率11.1 MHz)，于大鼠頭頂部探測上矢狀竇，待波形穩定后，測量上矢狀竇管徑及血流速度。剪應力(τ)=4μQ/πr3，其中Q=1/4πd2v×60。其中Q為血流量，r為血管半徑，d為血管內徑，v為血流速度，μ為血液黏度系數。

1.5 Western印跡法測定硬膜組織AIBP、VEBF蛋白表達 取硬膜組織勻漿，離心，取上清，進行蛋白定量和免疫印跡檢查。各樣品總蛋白(40 μg)電泳，5%脫脂奶粉37℃封閉2 h，一抗(AIBP 1∶800；VEGF 1∶2 000) 4℃孵育過夜，HRP標記的二抗(1∶50 000)37℃搖床孵育2 h，TBST充分洗滌。將ECL試劑中增強液與穩定的過氧化物酶溶液按1∶1比例混勻，顯影。用BandScan軟件分析膠片灰度值。

1.6 實時熒光定量PCR檢測mRNA 取硬膜組織勻漿，加入TRIzol試劑，冰上提取RNA。然后根據反轉錄試劑盒說明書合成cDNA。AIBP引物序列：正向為5′- AGA CTT GCT CAT ATC CCT CAC A-3′，反向為5′-CAG ACG ATA GAC ACA CTC GGT-3′。VEGF引物序列：正向為5′-CTT GCC TTG CTG CTC TAC CT-3′，反向為5′-GCA GTA GCT GCG CTG ATA GA-3′。數據以2-ΔΔCt進行分析。

1.7 免疫組化 制備硬腦膜組織石蠟切片，脫蠟，蘇木精染色，光鏡下觀察硬膜及附近血管病理變化。采用Image-Pro Plus軟件處理染色后的免疫組化切片，計算平均光密度值。校正光密度后，設置測量參數，選擇測量區域，設置色彩，測量該區域的面積；平均光密度=累計光密度/區域面積。

1.8 細胞中AIBP、VEGF及總膽固醇含量測定 將制備好的細胞懸液以1 000 r/min離心10 min后取細胞上清液，按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測HUVEC中AIBP及VEGF含量。將制備好的細胞懸液以1000 r/min離心10 min，留取細胞沉淀，按照總膽固醇測定試劑盒說明書檢測細胞內膽固醇含量。

1.9 統計學處理 使用SPSS 18統計軟件進行統計學分析。正態分布數據采用方差分析，組間比較采用LSD-t及Dunnett-t檢驗；偏態分布數據組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。檢驗水準(α)為0.05

2 結 果

2.1 各組大鼠上矢狀竇血流動力學的比較 大鼠飼養3個月后，取建模成功者48只測量并計算上矢狀竇剪應力。結果(表1)顯示：與D組相比，A、B組上矢狀竇內流速明顯加快，剪應力明顯升高，差異均有統計學意義(P<0.05)；C組上矢狀竇內流速及剪應力改變不明顯。結果(圖1)表明：剪應力與流速正相關。

表1 各組大鼠上矢狀竇血流動力學指標比較

A組：右側頸動脈-頸外靜脈吻合術+左側橫竇閉塞術+頂骨磨除術；B組：右側頸動脈-頸外靜脈吻合術+頂骨磨除術；C組：右側頸動脈結扎術+右側頸外靜脈結扎術+頂骨磨除術；D組：頂骨磨除術.*P<0.05與D組相比較

圖1 上矢狀竇流速與剪應力的關系

2.2 各組大鼠硬膜組織中AIBP和VEGF蛋白的表達 Western印跡結果(圖2)顯示：術后3個月，A組、B組硬膜組織中AIBP表達明顯低于D組(P<0.01)，C組與D組間差異無統計學意義；A組、B組硬膜組織中VEGF表達明顯高于D組(P<0.01)，C組與D組間差異無統計學意義。

2.3 各組大鼠硬膜組織中AIBP和VEGF mRNA的表達 real-time PCR檢測結果(圖3)顯示：術后3個月，A組、B組AIBP mRNA表達明顯低于D組(P<0.01)，C組與D組間差異無統計學意義；A組、B組VEGF mRNA高于D組(P<0.01)，C組與D組間差異無統計學意義。

2.4 各組大鼠AIBP免疫組化結果 免疫組化結果(圖4)顯示：AIBP在血管內皮層表達。A組AIBP平均光密度為0.001 6±0.000 2，B組為0.005 0±0.000 2，C組為0.007 1±0.000 5，D組為0.008 0±0.001 8。其中，A組、B組AIBP平均光密度值小于D組(P<0.05)，C組與D組間差異無統計學意義。

圖2 各組大鼠硬膜組織中AIBP和VEGF蛋白的表達

圖3 各組大鼠硬膜組織中AIBP和VEGF mRNA的表達

圖4 各組大鼠AIBP免疫組化情況

2.5 HUVEC形態 結果(圖5)顯示：體外培養下，正常HUVEC呈特征性的鋪路石樣改變；剪應力為10 dyn/cm2時，HUVEC被明顯拉長，沿流體方向排列；剪應力為5、2.5、1 dyn/cm2，HUVEC類似扁橢圓型。

2.6 HUVEC細胞上清液中AIBP、 VEGF及細胞中總膽固醇含量 結果(圖6)顯示：與無剪應力與剪應力為1 dyn/cm2時相比，剪應力為10、5、2.5 dyn/cm2時，細胞上清液中AIBP降低、VEGF升高，細胞中膽固醇總含量升高(P<0.05)。

圖5 HUVEC在不同剪應力條件下形態學改變

A：剪應力為10 dyn/cm2；B：剪應力為5 dyn/cm2；C：剪應力為2.5 dyn/cm2；D：剪應力為1 dyn/cm2；E：無剪應力. Original magnification: ×100.n=3

圖6 不同剪應力條件下HUVEC中AIBP、 VEGF及總膽固醇的含量表達

3 討 論

3.1 DAVF模型的建立 人工誘導DAVF的動物模型最早由Terade等[7]在1994年通過結扎大鼠頸外靜脈和頸總動脈建立，但該種方法的誘導率較低。之后Herman等[8]通過吻合頸外靜脈和頸總動脈，并結扎上矢狀竇和對側橫竇出口，建立靜脈高壓大鼠模型，誘導率提高了40%。Kojima等[9]通過對比頸動脈-頸外靜脈吻合聯合結扎對側橫竇出口組和單純頸動脈-頸外靜脈吻合組發現，前者術后即刻的引流靜脈壓力升高至(35±5)mmHg，同時DAVF的誘導率提高。本課題組前期研究[10]通過建立不同靜脈高壓大鼠模型，構建不同梯度的靜脈壓力，結果提示DAVF的形成與靜脈流出道的壓力梯度正相關。本研究結合前期研究及其他研究者的方法[11]，采用以下靜脈端壓力梯度：動靜脈吻合+對側橫竇閉塞組為15～20 mmHg，單純動靜脈吻合組為10～12 mmHg，動靜脈結扎組為1～3 mmHg。

3.2 剪應力改變導致VEGF升高的機制 關于靜脈高壓誘發DAVF形成的機制學說較多，其中以血管新生機制研究最多[12]。一般認為，靜脈高壓啟動了VEGF介導的硬膜血管新生，從而誘導DAVF的發生和進展。靜脈高壓上調VEGF的機制中，除低氧誘導因子(HIF)通路[13]外，剪應力、壓力、牽張力等機械刺激在血管新生中也發揮重要作用[14-15]。

本研究中，靜脈高壓可導致大鼠上矢狀竇的剪應力增大，靜脈壓力變化不大時，可能由于大鼠顱內其他靜脈引流的緩沖作用，剪應力無明顯變化。剪應力與管腔內液體流速、管腔直徑及液體黏度等因素有關。本組實驗中，剪應力的改變主要取決于靜脈竇內流速改變。動物模型建立后3個月，靜脈高壓導致的血流分布應達到了新平衡。Western 印跡及real-time PCR提示，靜脈端壓力增高可使VEGF分泌增加，基因表達上調，與前期研究[10]相符，進一步提示靜脈高壓導致的剪應力增大可能與VEGF表達上調相關。

內皮細胞為血管壁的最內層，直接與血流接觸，可以較為敏感地感知血液中炎癥因子、激素變化及血管的機械刺激。HUVEC傳代多次仍可保證細胞狀態穩定，不易發生變性。本研究選擇HUVEC進行進一步體外實驗。該部分實驗中，以剪應力為唯一變量，排除靜脈高壓造成的其他影響，包括缺氧、靜水壓力等改變，且實驗對象單一穩定，個體差異小，同時較其他研究[16]增加了實驗組組數。結果發現，無機械刺激時，HUVEC呈典型的鋪路石樣生長，剪應力升高時，細胞被拉長，提示剪應力是影響內皮細胞形態及功能改變的重要因素。

內皮細胞將機械信號轉化為化學信號，介導血管新生的機制尚不明確。有學者[14]認為，Cl-通道在該過程中發揮重要作用。也有學者[15]發現，剪應力作用下，內皮細胞中整合素、FLK-1等表達上調，使細胞黏附能力和抗凋亡能力升高，進而啟動血管新生。dela Paz等[16]發現，與無剪應力培養相比，HUVEC在高剪應力下培養72 h后，VEGF表達明顯上調，其 mRNA上調了5倍，且VEGFR的表達量及磷酸化水平也分別升高為無剪應力時的4倍和6倍。本研究中，剪應力為10、5、2.5 dyn/cm2時，VEGF分泌明顯增加，與dela Paz等的結果相符。但剪應力為1 dyn/cm2時，VEGF表達無明顯差異，分析原因可能：(1)剪應力變化不大時，機械刺激不足以通過啟動細胞膜上相應的門控通道來調控VEGF；(2)內皮細胞除受到血管內各種機械、生物刺激外，血管壁平滑肌細胞對其形態、功能也有影響，單一的內皮細胞培養與2種細胞聯合培養的生物環境差異也可能導致結果不同。

3.3 膽固醇代謝導致血管新生機制 膽固醇對于維持細胞的正常結構及各項功能的運行至關重要，但過量的膽固醇可加重細胞的代謝負荷。細胞內負責膽固醇代謝的2種關鍵轉運蛋白，即三磷酸腺苷結合盒轉運體 A1(ABCA1)和三磷酸腺苷結合盒轉運體 G1(ABCG1)，在細胞調控、炎癥反應和細胞凋亡等過程中均發揮作用。在調節膽固醇運輸過程中，ABCA1主要促進膽固醇運輸至細胞外的載脂蛋白A-Ⅰ(apoA-Ⅰ)， ABCG1 則介導膽固醇運輸至成熟的高密度脂蛋白。研究[17]發現，apoA-Ⅰ可通過 ABCG1 促使膽固醇從細胞膜的脂筏流向細胞外，該過程抑制 CD40L/CD40 介導的促炎效應，提示膽固醇流出可能參與多種生物學功能。 Terasaka等[18]發現，ABCG1 和高密度脂蛋白通過調控內皮型一氧化氮合酶來調節血管內皮細胞的功能，進而提高血管通透性，導致炎性細胞滲透入組織，該過程可能促進動脈粥樣硬化斑塊中的病理性血管新生。而最新針對動脈粥樣硬化的研究[19-20]指出，高剪應力條件下一氧化氮可下調ABCA1，而低剪應力條件下 ABCA1 的表達相對增高。此外，剪應力可使細胞內多種蛋白亞硝基化，從而起到與NO類似的作用，最終導致產生內皮微粒，這可能是動脈粥樣硬化發生的重要通路。

膽固醇升高啟動VEGF介導的血管新生機制目前仍不明確。Fang等[6]研究者指出AIBP和高密度脂蛋白共同參與膽固醇代謝，通過抑制內皮細胞中膽固醇向胞外流出，阻斷 VEGF 介導的血管新生通路。本研究結果顯示，高剪應力導致AIBP分泌減少，基因表達下調，提示AIBP可能在血管剪應力作用下，通過減少細胞膜上的膽固醇流出，促進VEGF介導的血管新生。但是，靜脈端壓力增加后，除了剪應力的改變，上矢狀竇內的靜水壓力、牽張力等也會發生變化，且靜脈高壓會造成腦組織低灌注，誘發缺血缺氧，這些因素均可導致膽固醇代謝紊亂，從而啟動VEGF調控的血管新生。

本研究體外實驗結果顯示，排除靜水壓、組織缺血缺氧等因素干擾后，高剪應力條件培養時，HUVEC分泌AIBP明顯減少，并使膽固醇向胞外流出減少，導致細胞內的總膽固醇含量增加，而對應的細胞分泌VEGF升高，與Fang等[6]的研究結果相符。

綜上所述，靜脈高壓造成的剪應力改變可以調控大鼠硬膜組織中VEGF及AIBP的表達水平，AIBP可能通過調控膽固醇代謝調節VEGF介導的血管新生。本實驗的局限性在于：調控VEGF表達通路多而復雜，動物實驗未排除剪應力之外的其他因素的影響；體外實驗顯示剪應力改變可以調控AIBP的表達，但不能明確AIBP調控的膽固醇增加是調控VEGF上調的重要通路，還是VEGF上調的伴隨現象。后續研究將借助基因工程學等技術沉默AIBP基因或使其過表達，進一步驗證其是否對VEGF存在直接調控作用。