維甲酸相關孤兒核受體C可通過抑制糖酵解來調節宮頸癌細胞增殖

陳 瑋， 王 靜， 董 曦

復旦大學附屬中山醫院生殖醫學中心，上海 200032

宮頸癌是婦科最常見的惡性腫瘤之一，是僅次于乳腺癌的第二大常見的女性腫瘤，是女性癌癥發病和死亡的第四大主要原因[1-3]。該病每年新發病例約50萬例，且呈每年0.6%的上升趨勢，平均死亡年齡為55歲[4]。宮頸癌轉移導致約90%患者死亡[5]。手術聯合以順鉑為主的化療是宮頸癌的主要治療方法。約1/3的宮頸癌患者經歷了復發，且復發大多發生在治療結束后2年內[5]。

腫瘤細胞獲取能量主要依賴于糖酵解途徑[6]。此途徑能為細胞增殖、轉移等過程高效、快速地提供能量[7]，能夠滿足腫瘤細胞快速增長對能量的需要，并在競爭能量時比正常細胞更占優勢[6]。維甲酸相關孤兒核受體C(RORC/RORγ)是維甲酸相關孤兒核受體家族成員之一，在一些腫瘤發生發展中發揮重要的調控作用[8-10]。但RORC在人宮頸癌細胞中的表達和功能還未被深入研究。缺氧誘導因子1(hypoxia-inducible factor-1，HIF-1)已被證實在人體多種實體性腫瘤的生長、轉移、血管形成等過程中具有關鍵的調控作用[11-13]。其中，HIF-1α是主要的促進糖酵解的轉錄因子[14-15]。因此，本研究將重點探討RORC在宮頸癌腫瘤細胞代謝中的調控作用，揭示RORC能否通過調控HIF-1α表達轉錄來影響宮頸癌細胞糖代謝，進而抑制宮頸癌細胞增殖。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要檢測試劑 人宮頸癌細胞系購自中國科學院上海生命科學學院細胞庫。細胞培養所需試劑(DMEM培養基、胰酶、血清和PBS緩沖液等)購自Gibco公司(美國)[16]。細胞增殖檢測試劑盒購自Dojindo Molecular Technologies公司(日本)[16]。糖代謝檢測試劑盒購自Biovision公司(美國)[16]。本研究中所使用的抗體購自ProteinTech生物公司(中國)[16]。

1.2 細胞培養 Siha和HeLa細胞培養于37℃、體積分數為5%的CO2培養箱中，使用0.25%胰蛋白酶消化傳代。處于對數生長期的細胞可用于后續各項實驗研究。

1.3 RORC過表達細胞構建 RORC過表達慢病毒購于漢尹生物科技(上海)有限公司。將Siha和HeLa細胞接種于6 cm培養皿中，其密度為60%～70%時，每個培養皿細胞用50 μL病毒感染24～48 h，隨后使用嘌呤霉素(2.5 μmol/L)進行篩選，并使用免疫印跡方法進行驗證。

1.4 CCK-8細胞增殖實驗 將構建好的RORC過表達細胞及其對照細胞，計數稀釋至50 000個/mL，接種于96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液，設置3個復孔，置于培養箱中培養，每隔24 h測定光密度值(450 nm)，連續測定5 d。本實驗需重復3次以上，最終根據測定結果繪制細胞增殖曲線。

1.5 葡萄糖代謝檢測 取3×104個細胞置于70 μL培養基中，分裝于96孔板中，在細胞培養箱過夜培養，隨后按照糖代謝檢測試劑盒說明書測定其相應的細胞葡萄糖攝取水平。

1.6 Western 印跡檢測 收集RORC過表達宮頸癌細胞及對照組宮頸癌細胞沉淀，制備成3 μg/μL的蛋白液，利用SDS-PAGE電泳進行檢測，使用8%的脫脂牛奶封閉1 h，一抗4℃溫育12 h以上，二抗室溫溫育2 h以上，利用化學發光法進行目的蛋白條帶檢測。

1.7 啟動子活性檢測 利用雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測HIF-1α啟動子活性，其操作過程參照以往研究[16]。

2 結 果

2.1 RORC在宮頸癌細胞中的表達水平和對宮頸癌細胞增殖的影響 Western印跡結果(圖1A)顯示：RORC過表達宮頸癌細胞中RORC蛋白表達水平明顯升高。CCK-8檢測結果(圖1B)表明：RORC表達增強后能夠抑制宮頸癌細胞Siha和HeLa的增殖(P<0.05)。

2.2 RORC對宮頸癌細胞糖代謝水平的影響 使用糖代謝檢測試劑盒檢測RORC過表達細胞系，結果(圖2)發現，RORC表達上調后可以抑制宮頸癌細胞葡萄糖攝取水平和乳酸生成水平(P<0.05)。

圖1 過表達RORC對宮頸癌細胞增殖的影響

2.3 HIF-1α可能是RORC潛在的作用靶點 免疫印跡檢測(圖3A)發現，RORC表達增強后，可以明顯抑制宮頸癌細胞內HIF-1α、GLUT1和LDHA蛋白的表達水平(P<0.05)。報告基因檢測(圖3B)進一步發現，RORC可以抑制HIF-1α啟動子活性，表明RORC可能通過抑制HIF-1α轉錄來調節其下游靶基因的表達(P<0.01)，進而影響宮頸癌細胞糖代謝以及增殖過程。

圖2 過表達RORC對宮頸癌糖代謝攝取與乳酸生成水平的影響

圖3 RORC對糖代謝相關基因表達(A)及HIF-1α(B)啟動子活性的影響

3 討 論

RORC對腫瘤細胞的增殖抑制作用在乳腺癌、黑素瘤和前列腺癌等多種腫瘤中有報道。RORC在乳腺癌中主要通過與蛋白質精氨酸甲基轉移酶2(PRMT2)相互作用，影響DNA損傷修復[9]；RORC在前列腺癌中通過作用于PD-L1/ITGB6/STAT3通路影響腫瘤細胞糖酵解[16]等機制抑制腫瘤細胞增殖。本研究結果表明，RORC能抑制宮頸癌細胞的增殖。

本研究證明，RORC可通過抑制HIF-1α的表達及活性來降低宮頸癌細胞糖代謝水平，從而抑制細胞增殖。以往研究[17]發現，HIF-1α在多種腫瘤中呈高表達狀態，在調節糖酵解過程中發揮著重要的轉錄調控作用。HIF-1α活性被抑制后，腫瘤細胞生長速度明顯放緩[18]；進一步研究[19]發現，一些重要的糖酵解限速酶如GLUT1、LDHA、己糖激酶(HK)等的轉錄均受HIF-1α調控，進而影響腫瘤糖代謝及增殖。另外，HIF-1α還可以與其他轉錄因子(如c-Myc)協同調控糖代謝限速酶轉錄表達[20-21]。本研究發現，RORC能夠有效抑制HIF-1α、GLUT1、LDHA的表達及HIF-1α啟動子的活性，進一步印證了RORC通過影響糖酵解，使得細胞快速增殖所需的能量供給不足，從而抑制宮頸癌細胞增殖。

綜上所述，本研究發現RORC在轉錄水平調控HIF-1α的轉錄表達，進而減少GLUT1和 LDHA的表達，降低宮頸癌細胞糖酵解水平，達到抑制其增殖的目的。