費城染色體陽性急性淋巴細胞白血病ABL激酶區突變的特征分析及其臨床意義

傅維佳, 胡曉霞， 王麗炳， 黃愛杰， 高 磊， 倪 雄， 陳 莉， 章衛平， 王健民， 楊建民

海軍軍醫大學長海醫院血液科，中國人民解放軍血液病研究所，上海 200433

費城染色體陽性急性淋巴細胞白血病(philadelphia chromosome positive acute lymphoblastic leukemia, Ph+ALL)是一種伴重現性細胞遺傳學異常的急性淋巴細胞白血病，發病率隨年齡增長而升高，在兒童急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia,ALL)中占5%[1]，在成人ALL中約占25%[2]。酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)聯合化療緩解率達90%；患者經TKI治療后總生存率為40%～60%[2-3]。隨著TKI使用時間延長，可發生耐藥，而ABL激酶區突變是TKI耐藥最常見的原因，已報道的突變類型超過100種[4-7]。而國內報道多集中在TKI耐藥的慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia, CML)[4-5]。本研究回顧性分析了我中心收治的38例發生TKI耐藥的Ph+ALL患者的臨床特征、預后、分子遺傳學以及ABL激酶區突變的特征，并探討異基因造血干細胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)在TKI耐藥Ph+ALL患者中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本中心2010年1月至2019年3月收治Ph+ALL患者共99例，診斷標準參照2016版WHO造血與淋巴組織腫瘤分類[8]，除外混合表型急性白血病及CML急性淋巴細胞白血病轉變。99例患者中，發生TKI耐藥38例。

1.2 分子生物學檢測 BCR/ABL融合基因檢測：采用實時熒光定量PCR技術(RQ-PCR)檢測BCR/ABL P190和P210的轉錄本水平。ABL激酶區突變檢測：早期采用RQ-PCR檢測ABL激酶區突變；后期應用二代測序技術(NGS)，采用Ion Torrent測序平臺對ABL激酶區相關的基因突變進行目標區域PCR富集和高通量測序。

1.3 治療方法 誘導和鞏固治療方案以Hyper-CVAD/MA(環磷酰胺+蒽環類+長春堿+地塞米松/甲氨蝶呤+阿糖胞苷)和CHALL-01方案為主，共8個療程。CHALL-01方案是以VDP(長春堿+柔紅霉素+地塞米松)為基礎制定的化療方案，包括誘導化療、6個療程鞏固治療(Block 1～6)及維持治療三部分(表1)。采用三聯藥物(甲氨蝶呤+阿糖胞苷+地塞米松)鞘內注射預防中樞神經系統白血病。

至少鞏固2個療程后，僅接受化療的患者采用POMP(長春新堿+6-巰基嘌呤+甲氨蝶呤+強的松)維持治療2年，并長期口服TKI；有合適供體時行allo-HSCT，預處理和預防移植物抗宿主病(GVHD)方案見參考文獻[9-10]。接受allo-HSCT者從移植后第3個月開始，血小板計數>50×109/L且中性細胞絕對值>1×109/L時開始使用TKI，1年后停用。

表1 CHALL-01 方案

所有Ph+ALL患者均在診斷1周內給予TKI治療，根據血液學不良反應調整劑量。出現TKI耐藥時，換用其他TKI，并行ABL激酶區突變檢測，同時進行骨髓細胞形態學、免疫學、細胞遺傳學和分子生物學檢測。

1.4 評估指標 療效評估標準參見文獻[11-12]。完全分子學緩解(complete molecular remission，CMR)：BCR/ABL融合基因檢測為陰性；主要分子學緩解(major molecular remission，MMR)：BCR/ABL融合基因拷貝數較基線下降3個數量級或以上，但是不符合CMR標準。總生存期(overall survival，OR)2指從發現TKI耐藥日至患者死亡日或隨訪截止日期。無復發生存期(relapse free survival, RFS)2指TKI原發耐藥的患者達完全緩解(complete remission，CR)日至第1次復發、死亡或隨訪截止之日，或失去MMR或CMR的患者再次達到MMR或CMR日至第2次復發、死亡或隨訪截止之日，或血液學復發的患者再次達到CR日至第2次復發、死亡或隨訪截止。

TKI耐藥診斷標準[13-14]：當患者出現下述表現之一即診斷為TKI耐藥：(1)用藥后3個月未達到CR(原發耐藥)；(2)失去MMR或CMR；(3)血液學復發。

1.5 隨 訪 主要采用病案查詢、門診及電話進行隨訪。所有患者隨訪至2019年5月31日，中位隨訪時間為55(3～109)個月。

1.6 統計學處理 采用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。連續變量采用秩和檢驗，分類變量采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法，進行log-rank檢驗并繪制生存曲線。檢驗水準(α)為0.05。

2 結 果

2.1 患者一般特征 結果(表2)顯示：99例Ph+ALL患者中，男性54例(54.55%)、女性45例(45.45%)，診斷時中位年齡44(14～76)歲，中位白細胞計數(WBC) 39.7(1.3～329.0)×109/L，中位血紅蛋白(HGB) 98(30～174)g/L，中位血小板計數(PLT) 41(1～316)×109/L。86例患者有核型數據，其中伴有附加染色體異常29例(29/86，33.72%)。P190陽性69例(69/99，69.70%)，P210陽性30例(30/99，30.30%)。

TKI耐藥的Ph+ALL患者共38例(38/99，38.38%)，初診時WBC較未耐藥組高(P=0.014)；耐藥組與未耐藥組患者性別、年齡，初診時HGB、PLT、骨髓原始細胞比例、染色體核型、BCR/ABL融合基因、移植情況等差異無統計學意義。

2.2 預后分析

2.2.1 患者總體預后 所有Ph+ALL患者均在診斷1周內給予TKI治療，其中95例予伊馬替尼，起始劑量400 mg/d，4例予達沙替尼，起始劑量100 mg/d，根據血液學不良反應調整劑量。1～2個誘導療程的CR率為91.92%(91/99)；50例患者(50.51%)3個月內達到MMR，34例(34.34%)達到CMR。99例患者的中位OS為33.8(0.6～106.5)個月，5年OS率為(49.0±5.4)%。91例CR患者中位RFS為15.8(0.3～105.9)個月，5年RFS率(40.6 ±5.8)%。至隨訪截止日期共47例患者死亡，主要死亡原因為疾病復發(21例，44.68%)、感染(8例，17.02%)。

2.2.2 耐藥患者預后 結果(圖1)顯示：38例TKI耐藥患者的中位耐藥時間為治療后8(1～64)個月，其中31例同時出現血液學復發。4例患者(10.53%)伊馬替尼原發性耐藥；28例患者(73.68%)在鞏固治療過程中出現耐藥(26例伊馬替尼，2例達沙替尼)；6例患者(15.79%)移植后出現伊馬替尼耐藥且疾病復發。

2.2.3 耐藥組與非耐藥組患者預后比較 結果(表2)顯示：TKI耐藥組患者3個月內達到MMR者占34.21%(13/38)，顯著低于未耐藥組(60.66%，37/61；P=0.010)。結果(圖2)顯示：TKI耐藥組與未耐藥組的中位OS率分別為22個月和未達到，預計5年OS分別為(34.2±8.0)%和(61.4±6.7)%(P=0.044)；TKI耐藥組與未耐藥組中位RFS分別為8個月和未達到，預計5年RFS率分別為(6.7±4.5)%和(68.6±6.8)%(P<0.001)。

2.2.4 耐藥組移植與未移植患者預后比較 結果(圖3)顯示：32例患者移植前發生TKI耐藥，其中13例接受allo-HSCT，移植患者與未移植患者中位OS2率分別為未達到和3個月(P<0.001)。移植后患者全部達到血液學CR，其中10例達到CMR，CR與CMR患者中位RFS2率分別為未達到和16個月。移植患者與未移植患者的1年OS2率分別為(68.4±13.1)%和(17.8±9.2)%(P<0.001)，PFS2率差異無統計學意義。

表2 Ph+ALL患者一般情況

實驗室指標均為初診時數據. WBC：白細胞計數；HGB：血紅蛋白；PLT：血小板計數；MMR：完全分子緩解；CMR：部分分子緩解

圖1 TKI耐藥Ph+ALL患者的治療過程

圖2 Ph+ALL患者的生存曲線

圖3 TKI耐藥患者的生存曲線

2.3 TKI耐藥Ph+ALL患者ABL激酶區突變分布 結果(表3)顯示：38例患者中，20例(52.63%)存在ABL激酶區突變，共10個位點12種突變類型。9例患者發現T315I突變，占突變患者的45.00%，其次為E255K/V和Y253H/F，分別占突變患者的40.00%(8/20)和15.00%(3/20)。4例患者(4/20，20.00%)同時檢測出多重突變(出現1種以上ABL激酶區突變)。

T315I突變的9例患者中，1例患者于誘導化療過程中同時出現T315I和E255K突變，CART-19細胞免疫治療后達血液學CR，行allo-HSCT；1例患者于鞏固化療過程中發生T315I突變，采用HVP(高三尖杉酯堿+長春地辛+地塞米松)方案化療后再次血液學CR，后行allo-HSCT，持續隨訪；余7例患者均復發死亡。T315I突變組(9例)與未發生T315I突變組(29例)3年OS分別為(14.8±13.3)%和(39.3±9.2)%，差異無統計學意義(P=0.739)。

表3 20例ABL激酶區突變Ph+ALL患者的突變分布

3 討 論

TKI是治療Ph+ALL和CML重要的靶向藥。目前國內常用的TKI包括一代TKI伊馬替尼、二代TKI尼洛替尼和達沙替尼。TKI可能的耐藥機制包括：(1)BCR/ABL依賴機制，即ABL激酶區突變[6-7]、BCR/ABL融合基因的過表達和擴增[15]；(2)BCR/ABL非依賴機制，即激活替代信號通路，如Scr激酶家族[16]、克隆演化[17]；(3)藥物的吸收與外排機制，即人類有機陽離子轉運蛋白1(hOCT-1)介導的藥物內流減少[18]、多藥耐藥基因(MDR1)介導的藥物外流增加[19]；(4)呈相對靜止狀態的白血病干細胞介導的耐藥等[20]。

伊馬替尼耐藥的Ph+ALL患者中約70%可檢測到ABL激酶區突變，目前發現與耐藥有關的突變超過100種，其中T315I突變發生率最高[13-14]。研究[13]對189例發生伊馬替尼耐藥的Ph+ALL患者進行分析，發現69.3%(131/189)檢測出ABL激酶區突變，其中T315I突變占突變患者的37.4%(49/131)，其次為E255K和Y253H，均為19.08%(25/131)；10.69%(14/131)出現多重突變。本組38例TKI耐藥Ph+ALL患者中，共檢測到52.63%(20/38)發生ABL激酶區突變，其中T315I突變比例最高，占突變患者的45.0%(9/20)，其次為E255K/V 40.0%(8/20)和Y253H/F 15.0%(3/20)。本組檢測出的ABL激酶區突變比例較以往研究報道稍低。造成該差異的原因可能為：一方面可能由于本中心早期采用RQ-PCR技術檢測ABL激酶區突變，共檢測6個位點13種突變類型(Y253H、E255K/V、V299L、T315A/I、F317V/I/C/L、F359V/C/L)，突變檢出率較低；另一方面可能由于國外研究中多對已經復發的患者進行ABL激酶區突變檢測，與本組患者的納入標準不一致。

聯合TKI治療使Ph+ALL的療效得到顯著提高，CR率達91.92%，3個月內達到MMR達50.51%，5年OS率(49.0±5.4)%，5年RFS (40.6 ±5.8)%，與國外報道[2-3]相似。發生TKI耐藥的患者預后較未耐藥者顯著下降(P<0.001)?；颊甙l生TKI耐藥后接受allo-HSCT亞組與未移植亞組1年OS2率分別為(68.4±13.1)%和(17.8±9.2)%(P<0.001)。國內也有學者[21]報道，當患者發生ABL激酶區突變后行allo-HSCT組中位OS為29個月，顯著較單純化療聯合TKI組長(17個月，P=0.034)。該結果表明，發生TKI耐藥后，allo-HSCT是可靠的治療選擇。

本組4例(4/20，20%)患者同時檢測出多重突變，且多伴有T315I突變。本研究中T315I突變患者(9例)與未發生T315I突變患者(29例)3年OS率分別為(14.8±13.3)%和(39.3±9.2)%，差異無統計學意義，與部分患者接受了CART治療和入組病例數較少有關。既往有報道指出高三尖杉酯堿通過下調抗凋亡蛋白髓細胞白血病因子-1(MCL-1)的穩定性，誘導腫瘤細胞凋亡，且不依賴BCR/ABL機制[22]。本組中2例患者于鞏固治療過程中疾病復發，1例合并多重突變(T315I、E255K、E255V、E355G)，Ponatinib聯合HVP方案化療未達CR，于骨髓抑制期因合并肺部感染死亡；1例合并T315I突變，HVP方案化療再次CR后行allo-HSCT，持續隨訪。對于含T315I突變的患者，高三尖杉酯堿或許是一種治療選擇，但仍需要積累更多的經驗。Ponatinib能抑制所有攜帶ABL激酶區單一突變(包括T315I突變)的BCR/ABL酪氨酸激酶活性，是美國食品藥品監督管理局(FDA)認證的唯一對T315I敏感的TKI藥物[23]。而Ponatinib對不同復合突變的療效不一，T315I和E255V的復合突變對ponatinib高度耐藥[23-24]。本組1例多重突變(T315I、E255K、E255V、E355G)患者Ponatinib治療失敗，可能與同一克隆的復合突變及基因組的穩定性進一步減弱有關，其機制還需更深入的研究。此外，Zabriskie等[24]報道了1例伴T315I突變的Ph+ALL患者的治療過程，予ponatinib治療后獲得完全細胞遺傳學應答，但7個月后病情進展，ABL激酶區突變檢測發現I315M突變。

本研究表明，Ph+ALL患者不同ABL激酶區突變具有不同水平的TKI抗性，檢測對TKI耐藥的突變對確定新的治療策略至關重要。發生TKI耐藥時，allo-HSCT是可靠選擇，在部分病例中還可以選擇細胞免疫治療，包括CART、單克隆抗體、雙特異性抗體、抗腫瘤藥物與單克隆抗體螯合制劑治療等[25]以優化臨床結果，但仍需要更多的臨床研究證實。此外，ABL激酶區突變并不能解釋所有TKI耐藥機制，其耐藥機制有待進一步研究。