鼠冠狀病毒核衣殼蛋白電荷非均一性與其磷酸化的相關(guān)性

文榮，王玉燕，葉榮

復旦大學上海醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院,教育部、衛(wèi)健委、醫(yī)科院醫(yī)學分子病毒學重點實驗室；病原生物學系，上海 200032

冠狀病毒(coronaviruses)是一類有包膜的單股正鏈RNA病毒，感染人或動物后引起呼吸道、消化道及中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變[1]。冠狀病毒基因組為目前發(fā)現(xiàn)的最大mRNA，長度為26.4～31.7 kb[1]。冠狀病毒屬于套式病毒目(Nidovirale)，復制過程中形成一系列有著共同5′-前導序列和3′-下游序列的亞基因mRNA，用于表達病毒不同的蛋白質(zhì)，這些較長mRNA的保真度依賴于該類病毒復制酶中外切酶ExoN的活性[2]。鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus, MHV)作為乙型冠狀病毒屬(betacoronavirus)的原型種，迄今為止仍是冠狀病毒分子機制和致病性研究的理想模型[3-4]。

病毒的核衣殼(Nucleocapsid, N)蛋白結(jié)構(gòu)相對保守，具有較強的同源和異源蛋白相互作用的能力，在病毒復制過程中能特異性識別并結(jié)合病毒的mRNA進而調(diào)控病毒復制，最終與基因組結(jié)合構(gòu)成病毒的核心[5]。鼠冠狀病毒MHV-A59的N蛋白含454殘基，構(gòu)成兩個保守結(jié)構(gòu)域, 即N端結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain，NTD)和C端結(jié)構(gòu)域(C-terminal domain，CTD)。NTD的結(jié)構(gòu)及電荷分布與其他冠狀病毒如嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒(severe acute respiratory syndromes coronavirus,SARS-CoV)、HCoV-OC43和IBV高度一致[6]。已有實驗證明磷酸激酶GSK-3通過催化SARS-CoV N蛋白S177和鼠冠狀病毒MHV-JHM N蛋白S197磷酸化，促進了N蛋白招募RNA解旋酶DDX1，從而提高模板切換來合成更長的亞基因組mRNA[7-8]。

蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)是重要的細胞信號轉(zhuǎn)導中介分子，參與細胞的應(yīng)激增殖分化、凋亡等[9]。PKC有9種同工酶，屬于AGC亞類，根據(jù)調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域和激活方式不同進一步分為常規(guī)、新型和非典型3個亞組，其活化依賴于小分子的結(jié)合、膜轉(zhuǎn)位和3個位點的磷酸化[10]。實驗證明PKC與多種病毒的復制和致病作用密切相關(guān)，如博爾納病病毒(Borna disease virus, BDV)感染導致各種神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，是由于病毒聚合酶輔助因子P蛋白通過PKC磷酸化并劫持其參與的神經(jīng)元重要信號通路分子所致[11]；PKC拮抗劑具有激活潛伏的人類免疫缺陷病毒1型(human immunodeficienty virus type 1, HIV-1)且能降低CD4+T細胞受體表達的雙重作用，可提高高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒療法(highly active antiretroviral therapy, HAART) 的效果[12]；另外，最近發(fā)現(xiàn)PKC通過結(jié)合流感病毒PB2招募磷酸化核衣殼蛋白單體聚集，從而與RNA形成有效的復制復合物[13]。

我們用鼠冠狀病毒MHV-A59感染的小鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系neuro-2a，通過細胞蛋白脂酰化抑制劑2-溴棕櫚酸(2-bromopalmitate, 2-BP)和蛋白酶體抑制劑MG-132處理，結(jié)合2D電泳和免疫印跡試驗分析了病毒復制及其N蛋白電負性與磷酸化之間的關(guān)系。結(jié)果提示鼠冠狀病毒復制及其N蛋白磷酸化不但與PKCα的活化水平有關(guān)，并且某些內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解(endoplasmic reticulum-associated protein degradation, ERAD)與相關(guān)蛋白組分折疊也參與了這一過程。

1 材料和方法

1.1 細胞及培養(yǎng)

neuro-2a細胞(ATCC? CCL-131)為小鼠腦神經(jīng)母細胞瘤細胞系[14]，購自中科院細胞生物學研究所；L2細胞(ATCC? CCL-149)為大鼠肺上皮細胞系，來自美國紐約州衛(wèi)生署Paul S. Masters博士實驗室[15]。兩種細胞均用含10%胎牛血清(Gibco)的高糖DMEM(HyClone)培養(yǎng)基，于37 ℃、5%CO2環(huán)境(CONTHERM MITRE SERIES 4000培養(yǎng)箱)中培養(yǎng)。細胞用1∶2～3稀釋的0.25%胰酶-EDTA(HyClone)消化，按1∶3～5培養(yǎng)瓶面積比分瓶，間隔3～4 d，俟細胞匯合度接近80%時傳代。小分子抑制劑處理鼠冠狀病毒感染細胞采用含2%胎牛血清的VP-SFM(Gibco)培養(yǎng)基(2%FBS/VP-SFM)。

1.2 病毒感染與滴度測定

鼠冠狀病毒MHV-A59野生株源自Paul S. Masters實驗室分離株Alb240[15]。病毒擴增取高滴度貯存液1 ml〔(1～5)×107PFU/mL〕，感染1個T25 neuro-2a細胞1 h，補完全培養(yǎng)基4 ml后培養(yǎng)48 h，至CPE≥80%時收集5 ml培養(yǎng)上清液，連續(xù)感染1個T75 neuro-2a細胞1 h，補無血清培養(yǎng)基20 ml培養(yǎng)48 h后收集上清液25 ml，離心除去細胞碎片后分裝并低溫儲存，同時測定病毒滴度。含高滴度病毒培養(yǎng)上清液合并后也可用于病毒顆粒純化，初步純化通常采用2次PEG沉淀[16]。

小分子抑制劑處理鼠冠狀病毒感染細胞：2-BP(Sigma)和MG-132(Calbiochem)分別用無水乙醇(國藥集團)和DMSO(Sigma)配成10 mmol/L儲存液，臨用前取適量用2% FBS/VP-SFM稀釋至終濃度，分別為25 μmol/L和10 μmol/L。鼠冠狀病毒儲存液根據(jù)培養(yǎng)皿和細胞數(shù)用2% FBS/VP-SFM稀釋至5×105PFU/mL(通常1.0 MOI)，感染neuro-2a細胞1 h后吸去，換用含抑制劑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在病毒感染后12、24和48 h收集培養(yǎng)上清液和細胞裂解液樣品。

病毒滴度用L2細胞噬斑法測定。L2細胞用D60培養(yǎng)皿培養(yǎng)36～48 h，直至達70%～80%匯合度，吸盡細胞培養(yǎng)基。將病毒上清液用含2%血清的DMEM按10倍系列稀釋，取合適稀釋度病毒1 mL加至細胞。37 ℃ 感染1 h后吸盡病毒稀釋液，加入7 mL 55 ℃溫育的瓊脂細胞培養(yǎng)液(0.95%瓊脂/5% FBS/DMEM)，凝固后在37 ℃ 、5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)約40 h，再覆蓋3 mL 55 ℃ 溫育的含0.05%中性紅的瓊脂細胞培養(yǎng)液，37 ℃ 、5%CO2條件下染色約8 h，計數(shù)噬斑數(shù)量。

1.3 N基因克隆與原核表達

MHV-A59 N基因克隆與原核表達采用已發(fā)表的方法[16]，即以質(zhì)粒pMH54[15]為模板，通過聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)獲得鼠冠狀病毒N蛋白基因片段(mN)。正向引物mN-1F序列為 5′-CGCCATATGATGTCTTTTGTTCC-TGGG-3′，反向引物mF-2R序列為5′-CGCAA-GCTTTTACACATTAGAGTCATCTT-3′。PCR片段用NdeⅠ和HindⅢ 位點克隆至載體pET-28a中6-His標簽下游，轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細胞DH5α。含目的基因質(zhì)粒pET-28a-m陽性克隆用PCR篩選和測序確認，然后制備小量質(zhì)粒并保存。重組MHV-A59 N蛋白表達首先用pET-28-mN轉(zhuǎn)化大腸埃希菌感受態(tài)細胞BL21，然后挑取單個菌落接種于100 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，25 ℃ 下220 rpm搖菌至OD600為0.5時加入1.0 mmol/L IPTG(Sangon)，繼續(xù)誘導培養(yǎng)6 h，離心收集菌體，-20 ℃ 保存。菌體用2.0 mL結(jié)合緩沖液(20 mmol/L sodium phosphate, 500 mmol/L NaCl, 20 mmol/L imidazole, pH7.4)(Sangon)懸浮，在冰浴上超聲波處理，收集裂解液并置 -80 ℃保存。上清液用結(jié)合緩沖液稀釋后，再用Ni柱(GE Healthcare)于4 ℃ 中進一步純化。

1.4 蛋白質(zhì)凝膠電泳

十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)：棄培養(yǎng)基后，培養(yǎng)細胞用預冷PBS洗3次，加入500 μL 1×IPP細胞裂解液 〔50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，150 mmol/L NaCl, 1% NP40(Roche)，1×蛋白酶混合抑制劑(Roche)〕，放入T25/D60培養(yǎng)皿，冰上置5 min，4 ℃ 中 12 000 rpm離心5 min，收集上清液并分裝(100 μL)，-80 ℃ 保存。電泳前取細胞裂解產(chǎn)物加等體積的2×SDS-PAGE上樣緩沖液，煮沸5～8 min。冷卻后 12 000 rpm離心2 min。凝膠制備及電泳用Bio-Rad Mini裝置完成，主要試劑購自Calbiochem和Amresco公司，分離膠濃度10%～12%，濃縮膠濃度5%。電泳條件：濃縮膠80 V 30 min，分離膠120 V 60 min，或全程恒流15 mA/gel。電泳后凝膠用去離子水洗3次，轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Bio-Rad)并用抗體檢測(見下)，或用考馬斯亮藍R250染色后直接拍照分析或做蛋白質(zhì)打點質(zhì)譜鑒定。凝膠圖片用Adobe PhotoShop CS5軟件調(diào)整參數(shù)，然后取目的蛋白點，最后用Image J軟件進行灰度比較分析。

2D電泳：吸去培養(yǎng)液后，細胞用預冷PBS洗3次，加入1.0 mL 1×IPG裂解緩沖液〔7 mol/L urea(Sigma)，2 mol/L thiourea(Sigma)，4% CHAPS(Bio-Rad)，0.5% bio-lyte 3-10 ampholytes(Bio-Rad)，40 mmol/L DTT(Bio-Rad)，1/100 (V/V) TURBO DNase I(Ambion)〕，放入T75/D100培養(yǎng)皿，冰上置15 min，4 ℃ 中 12 000 rpm離心5 min，收集上清液并分裝(120 μL)，-80 ℃ 保存。電泳前取120 μL IPG裂解樣品，加入30 μL水化液(IPG 緩沖液 +0.002%溴酚藍)，室溫平衡后吸取125 μL上清液并均勻加到7 cm膠條/槽(Bio-Rad)上，再用適量礦物油(Bio-Rad)完全覆蓋膠條，移至等電聚焦儀Ettan IPGphorⅡ(Amersham Biosciences/GE Healthcare)上被動水化7 h。然后梯度電泳：50 V 7 h，100 V 7 h，300 V 30 min，1 000 V(G)30 min，5 000 V(G)90 min，5 000 V 60 min。電泳完成后取出膠條，用10 mL去離子水漂洗1次，加入5 mL平衡1液〔6 mol/L urea, 75 mmol/L Tri-HCl(pH 8.8)，29.3%(V/V)glycerine，2% SDS，0.002%溴酚藍，0.05 g DTT〕平衡5 min，用去離子水再漂洗1次，加入5 mL平衡2液〔6 mol/L urea, 75 mmol/L Tri-HCl(pH 8.8), 29.3%(V/V)glycerol, 2%SDS, 0.002%溴酚藍, 0.125 g IAA(Bio-Rad)〕平衡5 min。將膠條放置前述SDS-PAGE裝置分離膠上方(一側(cè)放蛋白marker濾紙)，加入瓊脂糖封閉液(25 mmol/L Tris, 192 mmol/L glycine, 0.1% SDS, 0.5% agarose, 0.002%溴酚藍)，靜置3～5 min后開始電泳。

1.5 免疫印跡及抗體

蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印用Bio-Rad膜電轉(zhuǎn)移裝置(Mini Trans-Blot?)完成。PVDF膜用甲醇濕潤后，與濾紙和海綿墊浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液(48 mmol/L Tris-39 mmol/L glycine, 0.037% SDS，20%(V/V) Methanol)中15 min以上，將電泳分離的凝膠另用新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液浸泡，然后制備成膠膜“三明治”，疊層放入轉(zhuǎn)膜槽中并設(shè)置降溫裝備，500 mA恒流電泳2 h；轉(zhuǎn)膜完畢后取出PVDF膜，用PBS漂洗3次，做好標記和切割；用5%脫脂奶粉/PBS室溫封閉1 h，用PBST(0.05% Tween-20/PBS)沖洗后轉(zhuǎn)移至反應(yīng)槽或塑封袋內(nèi)；將特異性抗體用5%脫脂奶粉/PBST稀釋好，加入反應(yīng)槽中，4 ℃ 輕搖過夜；第2天用PBST漂洗，并加入用5%脫脂奶粉/PBST稀釋好的HPR標記二抗，室溫搖動孵育1 h；用PBST漂洗后加ECL(GE)，并立即用X光片或化學發(fā)光成像儀(Tanon?4600)曝光。

本研究抗MHV-A59 N蛋白單克隆抗體2E6為本實驗室制備[16]，廣譜磷酸化抗體anti-pSTY(SPM101)、磷酸激酶PKCa及S657磷酸化抗體〔均為兔單克隆抗體(RabMab?)〕購自Abcam，預染分子量標準(PageRuler?)購自Thermofisher，HRP-交聯(lián)GAPDH鼠單克隆抗體購自Proteintech。

1.6 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析

凝膠考馬斯亮藍染色出現(xiàn)蛋白點或條帶后，立即將蛋白質(zhì)點小心割下，搗碎后置于96孔微孔板中。先用60 μL脫色液脫色，然后用去離子水洗2次至膠粒透明，再用60 μL乙腈干燥2次。加入消化液(含0.01 μg/μL胰蛋白酶的20 mmol/L NH4HCO3溶液)置室溫孵育20 min，然后轉(zhuǎn)移到37 ℃ 孵育過夜。第2天用60 μL提取液(含0.1%三氟乙酸的50%乙腈溶液)提取2次，合并上清液，在N2保護下干燥。用0.8 μL基質(zhì)溶液重溶后點靶板。MALDI分析用 5 800 MALDI TOF/TOF分析儀(AB SCIEX)。設(shè)定每個點在700～4 000 m/z質(zhì)譜范圍內(nèi)采用正離子反射模式獲取一級質(zhì)譜，激光累積1 000次激發(fā)。質(zhì)譜(mass spectroscopy, MS)數(shù)據(jù)用內(nèi)標進行校準。母離子按如下標準選擇：每點最多選擇12個母離子，信噪比最低設(shè)置為25，排除人角蛋白酶降解峰、胰酶自降解峰及基質(zhì)峰。串聯(lián)質(zhì)譜采用2 500次激光累積和100分辨率的質(zhì)量窗口(半峰全寬度)。碰撞能量設(shè)置為2 kV。連續(xù)線性質(zhì)譜(MS/MS)數(shù)據(jù)采用默認校準。得到的數(shù)據(jù)用軟件MASCOT(V2.3)進行檢索，參數(shù)設(shè)定：NCBI蛋白庫，胰酶酶切，一個漏切位點，一級質(zhì)譜的容差為200 ppm，二級質(zhì)譜的容差為0.8D。

2 結(jié)果

2.1 鼠冠狀病毒核衣殼蛋白存在電荷非均一性和磷酸化

鼠冠狀病毒MHV-A59 N蛋白理論上相對分子質(zhì)量為49.7 kD, 454個氨基酸殘基中含有41個絲氨酸、22個蘇氨酸和11個酪氨酸，NetPhos 2.0預測有24種絲氨酸、5種蘇氨酸和1種酪氨酸共30個潛在的磷酸化位點，實際質(zhì)譜測定位6個，其中S170/S171修飾是隨機的[17]。結(jié)果發(fā)現(xiàn)病毒感染后(24～36 h)neuro-2a細胞表達的N蛋白并不是單一電泳遷移條帶，而感染后早期(12 h)的N蛋白為單一條帶(圖1A)。免疫印跡試驗顯示，N蛋白主要形成相對分子量40～55 kD的3種條帶，而大腸埃希菌表達的N蛋白及初步純化的病毒顆粒中N蛋白與之不完全一致，即原核細胞中缺少相對分子量較小的條帶，大部分情況下只有相對分子量最大的單一條帶[16]；而初步純化的病毒顆粒中相對分子量較小的條帶明顯增加，中間條帶則相對較少(圖1B)。

A:Time-course expression and phosphorylation of MHV-A59 N protein in neuro-2a cells. hpi: hours postinfection. B: N protein and phosphorylation of MHV-A59 from transformedEscherichiacolilysate, virus-infected neuro-2a lysate and PEG-purified virions.

圖1 鼠冠狀病毒核衣殼蛋白的非均一性及磷酸化

Fig.1 Heterogeneity and phosphorylation of murine coronavirus N protein

為了確定這種電泳遷移率的變化與蛋白磷酸化的關(guān)系，采用廣譜抗磷酸化抗體(Anti-pSTY)檢測了相應(yīng)的條帶。免疫印跡試驗顯示，感染早期病毒表達的單一條帶即N蛋白不與廣譜磷酸化抗體發(fā)生反應(yīng)，原核載體pET-28a表達的N蛋白也不與廣譜磷酸化抗體發(fā)生反應(yīng)，只有來源于病毒感染后期及病毒顆粒中N蛋白能與廣譜磷酸化抗體反應(yīng)，但病毒顆粒中N蛋白反應(yīng)明顯弱于細胞表達的N蛋白(圖1B)。結(jié)果提示磷酸化可能與N蛋白的降解有關(guān)，細胞中和病毒顆粒中N蛋白的磷酸化程度也不一樣，雖然在病毒感染鼠17Cl1細胞時兩者的磷酸化位點是相同的[17]。

2.2 鼠冠狀病毒復制及N蛋白電負性受抑制劑2-BP和MG-132的影響

為了進一步分析MHV-A59 N蛋白非均一性與其磷酸化及其他修飾關(guān)聯(lián)，我們選用了2種底物模擬競爭性小分子化合物2-BP和MG-132，對病毒復制及其N蛋白合成進行干預，前者抑制蛋白脂酰化修飾和膜結(jié)合功能，后者抑制蛋白降解作用[18-19]。用1.0 MOI MHV-A59感染neuro-2a細胞1 h，然后分別用含25 μmol/L 2-BP和10 μmol/L MG-132的低血清培養(yǎng)基(2% FBS/VP-SFM)替換，收集感染后24 h的培養(yǎng)上清液和細胞IPG裂解物，再用噬斑法測定活病毒滴度，2D電泳分離N蛋白并對抗體2E6進行檢測。結(jié)果顯示，2-BP抑制鼠冠狀病毒復制明顯強于MG-132(圖2A)；而鼠冠狀病毒N蛋白并未集中在某一等電點上，而是呈現(xiàn)連續(xù)性分布，但相對分子質(zhì)量變化不明顯(圖2B)。令人意外的是，2-BP處理導致了N蛋白集中在低等電點一側(cè)，而MG-132處理則使更多N蛋白遷移到高等電點一側(cè)(圖2B)。這一結(jié)果至少說明，2-BP處理細胞使病毒N蛋白表面攜帶更少的正電荷，而MG-132處理則使N蛋白表面攜帶更多的正電荷，與其磷酸化修飾后果表現(xiàn)一致。同時，更多磷酸化的N蛋白有利于鼠冠狀病毒的復制而提高了其滴度。

A:Effects of 2-BP and MG-132 on MHV-A59 titers (log10PFU/ml) in the supernatants of Neuro-2a cell culture at 24 hpi. **:P<0.01. B:Electromobility and reactivity to monoclonal antibody 2E6 of MHV-A59 N protein undergone 2D electrophoresis. Three panels are corresponding to the bottom three panels in Fig.4.

圖2 2-BP和MG-132對鼠冠狀病毒復制及核衣殼蛋白電負性的作用

Fig.2 Effects of 2-BP and MG-132 on the replication and N protein electronegativity of murine coronavirus

2.3 PKCa-S657磷酸化水平影響鼠冠狀病毒的復制及N蛋白磷酸化

為了確定2-BP和MG-132處理對鼠冠狀病毒MHV-A59 N蛋白電負性的影響與磷酸化的關(guān)系，首先測定了小分子抑制劑處理的感染細胞中N蛋白的磷酸化程度，然后分析兩者與細胞中優(yōu)勢PKCα的相關(guān)性。實驗結(jié)果顯示，2-BP處理的病毒感染細胞中N蛋白的合成減少，同時其磷酸化明顯降低(圖3A)；MG-132處理的病毒感染細胞中N蛋白合成和磷酸化也降低，但降低程度弱于2-BP處理組(圖3A)，兩者的下降趨勢與上清液中病毒顆粒滴度下降程度基本一致(圖2A)。另外，病毒感染和兩種抑制劑對未激活的PKCα無影響，但對其疏水基序磷酸化位點S657活化的PKCα(PKCα-pS657)則有不同程度的調(diào)節(jié)作用：病毒感染導致了PKCα-p S657明顯下降，2-BP也抑制PKCα-pS657，但兩者疊加卻作用不明顯(圖3B)；而MG-132的作用則不同， 雖然對細胞本身PKCα-pS657的作用無明顯提高，但能明顯拮抗病毒復制對PKCα-pS657的抑制作用(圖3B)。

A:Effects of 2-BP and MG-132 on expression and phosphorylation of MHV N protein in neuro-2a cells at 24 hpi with MHV-A59. The histograms represent the mean distribution and test of the gray values from triple experiments.*:P<0.05;**:P<0.01. B:Effects of 2-BP and MG-132 on PKCα phosphorylation in infected neuro-2a cells at 24 hpi with MHV-A59.

圖3 2-BP和MG-132對鼠冠狀病毒核衣殼蛋白磷酸化的影響

Fig.3 Effects of 2-BP and MG-132 on the phosphorylation of murine coronavirus N protein

2.4 ERAD相關(guān)蛋白穩(wěn)定有利于鼠冠狀病毒的復制

圖2和圖3結(jié)果顯示，鼠冠狀病毒復制導致細胞中磷酸化PKCα的消耗，MG-132拮抗這種消耗，從而保持了一定的病毒復制水平；而2-BP因抑制了細胞的PKCα磷酸化水平而病毒復制明顯降低。為了獲得參與調(diào)節(jié)鼠冠狀病毒N蛋白及其磷酸化的細胞蛋白相關(guān)線索，對病毒感染及2種小分子抑制劑處理的neuro-2a細胞進行了2D分離及對部分優(yōu)勢蛋白的質(zhì)譜鑒定(圖4)。結(jié)果顯示，其一，病毒感染后合成的大量N蛋白沿約50 kD遷延分布，與特異性單克隆抗體2E6反應(yīng)強烈(圖2B)；其二，病毒感染后一部分細胞蛋白合成被抑制，同時2-BP和MG-132也能抑制部分蛋白合成，但兩者形成的蛋白譜存在較明顯差異(圖4)。

如圖4所示，2-BP和MG-132兩者對細胞的結(jié)構(gòu)蛋白β-actin(黑圈)和α-enolase(紅箭頭)只有輕度的抑制。鼠冠狀病毒MHV-A59感染后α-enolase明顯減少，但對β-actin水平影響并不明顯，因此β-actin可以作為其他細胞蛋白變化的參考標準。我們觀察到與蛋白折疊和降解相關(guān)的輔助蛋白如HSP70-protein 9(綠箭頭)和Calrecticulin(藍箭頭)等的變化與抑制劑密切相關(guān)。該結(jié)果提示2-BP不但對細胞蛋白S-棕櫚酰化有抑制，而且間接抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運功能相關(guān)蛋白；MG-132則有利于維持這兩種蛋白的穩(wěn)定。

圖4 2-BP和MG-132對鼠冠狀病毒感染neuro-2a細胞優(yōu)勢蛋白表達的影響

Fig.4 Effects of 2-BP and MG-132 on the expression of dominant proteins of neuro-2a cells infected with murine coronavirus

3 討論

neuro-2a細胞是一種特化的鼠神經(jīng)母細胞瘤細胞系，產(chǎn)生大量微管蛋白，早期用于神經(jīng)纖維蛋白的合成、裝配和周轉(zhuǎn)的研究，證明了細胞朊蛋白的聚集作用[14]。我們前期的工作發(fā)現(xiàn)該細胞系表面能穩(wěn)定表達鼠冠狀病毒受體分子mCEACAM1a, 支持MHV-A59的復制，并產(chǎn)生多種信號轉(zhuǎn)導途徑的分子應(yīng)答[20]。另外，該細胞易于轉(zhuǎn)染，能有效表達外源基因，比較適合鼠冠狀病毒各種蛋白結(jié)構(gòu)與功能的分析[21]。值得注意的是，胎牛血清白蛋白對穩(wěn)定細胞生長相關(guān)因子非常重要，其本身也是促進細胞生長的重要成分；但與小分子2-BP或MG-132結(jié)合會影響其作用，因此不能用含高濃度血清的完全培養(yǎng)基分析其作用。neuro-2a細胞在無胎牛血清的DMEM中生長明顯減慢，且形態(tài)大小不均。為此我們選用商品化無血清培養(yǎng)基(VP-SFM)添加約2%胎牛血清來替代，10 μmol/L MG-132和25 μmol/L 2-BP均獲得很好的作用效果(圖2～4)。

鼠冠狀病毒N蛋白形成NTD和CTD兩個高度保守結(jié)構(gòu)域，前者主要結(jié)合調(diào)控病毒RNA復制，后者與自身同源聚集相關(guān)[22]。鼠冠狀病毒N蛋白形成特征性的磷酸化位點2個熱點簇，一個位于NTD與CTD之間的SR富含區(qū)，包括S162/S170/T177；另一個位于CTD與C端N3功能域之間，包括S389/S424/T428[17]。Wu等證明GSK3催化SARS-CoV N蛋白S177和MHV-JHM N蛋白S197磷酸化有利于病毒長模板RNA轉(zhuǎn)錄[8-9]。實驗中我們注意到，低等電點一側(cè)的N蛋白主要包含大相對分子質(zhì)量的未磷酸化組分，與病毒復制早期合成N蛋白一致；而高等電點一側(cè)的大相對分子質(zhì)量條帶除了含有磷酸化和未磷酸化者外，還包含了中間或小相對分子質(zhì)量未磷酸化組分，與病毒復制的后期合成一致(圖 1和圖 2B)。另外，廣譜磷酸化抗體Anti-pS/T/Y只與相對分子質(zhì)量最大的N蛋白條帶反應(yīng)，單克隆抗體2E6能與3種不同相對分子質(zhì)量的N蛋白條帶反應(yīng)(圖1和圖2B)。前者一般不能識別磷酸化位點上下游序列，后者識別區(qū)位于MHV-A59 N蛋白的NTD與CTD之間[16]。這些結(jié)果說明，相對分子質(zhì)量中等和較小的N蛋白條帶有可能是C端磷酸化位點之后序列被降解而形成，其中包含了具有與病毒其他結(jié)構(gòu)蛋白相互作用功能的N3結(jié)構(gòu)域[22]，說明裝配至成熟病毒顆粒N蛋白可能存在多種修飾形態(tài)。但是僅通過電泳結(jié)果和蛋白棕酰化抑制劑2-BP和蛋白酶體抑制劑MG-132處理不能推斷N蛋白電荷不均一性由其磷酸化引起。為了獲得電荷負載變化與磷酸化的直接關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)，我們試圖用抗體2E6通過免疫沉淀濃集3種不同處理的病毒N蛋白，再用HPLC-ESI-MS/MS對磷酸化位點進行定位[17]，但因所得蛋白的量和純度有限及MS技術(shù)問題未獲成功，此實驗仍在改進之中。另外，目前PKC抑制劑無型別特異性，對N蛋白磷酸化及電負性影響特異性大部分不如2-BP和MG-132。病毒N蛋白磷酸化機制和效應(yīng)目前仍未完全清楚，研究技術(shù)手段相對缺乏，本文提示電負性作為磷酸化修飾潛在指標值得進一步探索，雖然兩者之間相關(guān)性仍需更可靠的證據(jù)。

PKCα磷酸化是PKCα激活的基本條件之一，其C端結(jié)構(gòu)域中有3個位點可依次被磷酸化，首先位于激活環(huán)(activation loop)內(nèi)的T497能被PDK1磷酸化，隨后轉(zhuǎn)折基序(turn motif)上的T638和疏水基序(hydrophoblic motif)上的S657發(fā)生自動磷酸化[10]。MG-132在較高濃度時，也具有抑制細胞磷酸化的作用[23]。因此，PKCα-p S657代表了活化的PKCα。據(jù)此我們認為：①鼠冠狀病毒復制及其N蛋白的磷酸化依賴于活化狀態(tài)的PKCα；②2-BP抑制細胞活化狀態(tài)的PKCα-pS657產(chǎn)生而導致的病毒復制及其N蛋白的合成和磷酸化降低可能是通過抑制細胞蛋白脂酰化所致，因為膜定位能力對PKCα激活非常關(guān)鍵；③MG-132可能通過抑制磷酸化N蛋白的降解維持病毒的復制和裝配。

MG-132為醛基化亮氨酸三肽類似物(Z-Leu-Leu-leucinal)，是一種特異的、可逆的和滲透性強的20S蛋白酶體抑制劑，其導致不同種類腫瘤細胞凋亡與劑量有關(guān)[19]。我們發(fā)現(xiàn)10 μmol/L MG-132對鼠neuro-2a細胞不產(chǎn)生明顯凋亡作用，但能有效延緩鼠冠狀病毒感染導致的磷酸化PKCα及其他優(yōu)勢蛋白質(zhì)的降低，處理后病毒復制仍可維持在較高的水平(圖 3、圖 4)。這一結(jié)果與曾報道的MG-132抑制病毒復制和致病性并不完全一致，可能與抑制劑濃度和細胞系不同有關(guān)[24-25]。但結(jié)合2-BP同時對鼠冠狀病毒復制及細胞ERAD相關(guān)蛋白組分抑制現(xiàn)象推測：MG-132保護了ER結(jié)合蛋白不被蛋白酶體破壞，有利于復制后期病毒顆粒裝配所必需的雙層膜囊泡的形成[26]。ER蛋白是否參與病毒膜相關(guān)蛋白S、M、E合成與修飾以及細胞PKCα的活化過程，再通過N蛋白磷酸化調(diào)節(jié)病毒復制，仍待進一步實驗探索。

2-BP及其衍生物由于能特異性結(jié)合含DHHC基序的蛋白脂酰轉(zhuǎn)移酶(protein acyl transferases，PATs)而廣泛用于蛋白棕櫚酰化的研究[18]。病毒Ⅰ型膜融合蛋白易發(fā)生棕櫚酰化，因而2-BP能干擾這些病毒的復制，包括流感病毒HA、人類免疫缺陷病毒gp41、冠狀病毒S蛋白等[27]。但2-BP也能非特異性且不可逆地抑制一些細胞內(nèi)膜結(jié)合蛋白如Src家族成員的磷酸化而影響細胞代謝過程[28]。我們發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中含25 μmol/L 2-BP能夠部分抑制細胞膜蛋白和鼠冠狀病毒N蛋白合成及PKCα磷酸化(圖 2～4)。2-BP在10～50 μmol/L對病毒的抑制作用并無明顯劑量依賴性，但低于10 μmol/L作用不明顯，而高于50 μmol/L會導致neuro-2a細胞形態(tài)改變并凋亡(未發(fā)表數(shù)據(jù))。因此，我們推測2-BP導致的病毒復制不僅直接作用于病毒S蛋白的棕櫚酰化，也可能因細胞HSP70和HSP90/cdc37等伴侶分子減少間接抑制了PKCα磷酸化[29]，后者導致磷酸化N蛋白參與的復制酶-轉(zhuǎn)錄酶復合物(replicase-transcriptase complex, RTC)的結(jié)構(gòu)形成、RNA合成等功能受損[29-30]。另外，冠狀病毒RTC也可能具有活化的PKC受體(receptors for activated PKC，RACK)類似功能，支持PKCα磷酸化，但復制后期大量包膜蛋白尤其是糖基化S蛋白的累積導致伴侶蛋白HSP70等消耗，反饋抑制PKC-N磷酸化，啟動病毒進入顆粒裝配階段。