響應面法優化女貞葉中三萜類成分的提取工藝

嚴小童, 馮承濤

(安徽理工大學 化學工程學院，安徽 淮南 232000)

研究表明，三萜類化合物具有溶血、抗癌、解熱、抗炎、鎮痛、抗菌抗病毒等多種治療作用[1-2]，但三萜類化合物難溶于水，提取工藝有待優化。β-環糊精是一種具有特殊的呈閉合圓筒狀無臭，微甜，無毒的白色結晶粉末。其外表面是親水性的，內部則是疏水性的管腔，其空間能包合住適當大小的藥物分子，形成的包合物在水中有較大的水溶性，從而增加藥物的溶解度，改變藥物的特性[3-4]。β-環糊精分子可以與三萜類物質的分子形成可溶于水的復合物，利用β-環糊精能夠有效的增大三萜類物質的提取率。本文應用響應面法研究在不同因素下β-環糊精對女貞葉中三萜成分提取的輔助作用，以確定其最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 供試材料

女貞葉購于亳州中藥材大市場，經安徽科技學院中藥教研室毛斌斌老師鑒定為為木犀科女貞屬植物女貞(LigustrumlucidumAit.)的葉；BSA124S電子分析天平(賽多利斯有限公司);UV-650型紫外分光光度計上海美譜達有限公司);齊墩果酸對照品(純度98%，安徽酷爾生物工程有限公司);其他試劑均為分析純，購于國藥試劑公司。

1.2 實驗方法

1.3 測定項目及分析方法

1.3.1 齊墩果酸最大吸收波長的確定和標準曲線的繪制 精密稱取齊墩果酸標準品5.0 mg用甲醇溶解，置25 mL容量瓶中定容。分別吸取齊墩果酸對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL，分別置于10 mL具塞試管中，90 ℃水浴揮干溶劑后，加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL，高氯酸0.8 mL，60 ℃ 恒溫水浴顯色15 min后冷卻5 min，加冰醋酸稀釋至刻度，搖勻，用相同方法處理的溶液作為空白對照，用紫外分光光光度計測吸光度確定最大波長，并繪制標準曲線。

1.3.2 女貞葉中三萜成分的提取與測定 取2 g干燥女貞葉粗粉和2 g β-環糊精置于100 mL具塞三角錐形瓶中，量取無水乙醇溶液30 mL,稱定重量，40 ℃下超聲處理1 h，搖勻底液，趁熱抽濾，將獲得濾液在80 ℃水浴鍋中蒸干揮發乙醇得浸膏，用適量甲醇溶解浸膏得均勻溶液，精密量取一定量的濾液進行稀釋，加入適當顯色劑在最大吸收波長處測吸光度。根據標準曲線回歸方程測定濾液中的三萜成分質量濃度(C),計算三萜成分的提取率。

三萜成分的提取率 (mg/g)=C×n×V/M

其中式中C(mg/mL)為三萜成分的質量濃度，n為濾液稀釋倍數，V(mL)為濾液體積，M(g)為供試女貞子粉末質量。

1.3.3 單因素實驗考察設計 分別考察溶劑比(80%、75%、70%、65%、60% )、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30)、提取時間(20、30、40、50、60 min)、提取溫度(20、30、40、50、60 ℃)以及試樣量與β-環糊精之比(1∶0.5、1∶1、1∶1.5、1∶2、1∶2.5)5個因素對三萜提取率的影響[8]，其中將β-環糊精作為一個因素探究其對三萜提取率的綜合影響，最后根據對提取的率的影響程度，選取四個顯著因素進行響應面分析[5-6]。

1.3.4 響應面法優化實驗設計 單因素試驗篩選出了作用最為顯著的四組，即溶劑比、料液比、提取溫度以及β-環糊精用量為自變量，女貞葉中三萜的提取率為響應值，運用Design Expert 10.0軟件進行響應面分析。同時考察了溶劑比、料液比、提取溫度以及試樣量與β-環糊精之比交互作用對于女貞子三萜成分提取率的影響，并且建立各因素與提取率之間的數學模型[7-8]，實驗因素與水平見表1。

表1 響應面實驗因素與水平

2 結果與分析

2.1 最大吸收波長及標準曲線

以齊墩果酸為指標化合物，經紫外最大波長掃描，確定其最大吸收波長為540 nm 。在540 nm處測各濃度梯度標準品的吸光度，以質量濃度c(mg/mL)與吸光度值A建立回歸方程：A=57.727c-0.037 4，相關系數為0.996 0，線性范圍為0.003～0.015 mg/mL，其標準曲線詳見圖1。

圖1 齊墩果酸標準曲線

圖2 乙醇濃度對提取率的影響

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對提取率的影響 如圖2，乙醇體積分數在60%～75%范圍內，隨著乙醇濃度的增加，女貞葉中三萜成分的提取率呈現增長趨勢；在75%時達到最大值為3.82 mg/g，當大于75%時三萜提取率則逐漸降低，因此可見在乙醇濃度控制在75%時最為合適。

2.1.2 料液比對提取率的影響 如圖3所示，料液比控制在1∶10～1∶25范圍內時，隨著料液比不斷增加，三萜成分的提取率呈現增長的趨勢；在1∶40時達到最大值，三萜成分的提取率達到最大為3.68 mg/g;當料液比超過1∶25時，三萜成分的提取率開始逐漸降低，因此控制料液比在1∶25左右合適。

圖3 料液比對提取率的影響

圖4 試樣量與β-環糊精之比對提取率的影響

2.1.3 β-環糊精對提取率影響 如圖4所示，當試樣量與β-環糊精之比在1∶0.5～1∶1.5范圍內，隨著β-環糊精量的增加，三萜成分的提取率呈現增長的趨勢；當試樣量與β-環糊精的量之比為1∶1.5時，三萜成分的提取率達到最大，為4.23 mg/g;當試樣量與β-環糊精之比大于1∶1.5時，三萜成分的提取率開始逐漸降低，因此試樣量與β-環糊精之比選擇1∶1.5比較合適。

2.1.4 提取溫度對提取率的影響 如圖5所示，提取溫度在20～50 ℃范圍內時，提取率隨溫度的升高而升高；當提取溫度在50 ℃時提取率達到最大，為3.66 mg/g;當提取溫度超過50 ℃后，溫度升高，提取率下降，則最適宜的提取溫度為50 ℃。

圖5 提取溫度對提取率的影響

2.1.5 提取時間對提取率的影響 如圖6所示，提取率隨提取時間的變化而變化，當提取時間為50 min時，提取率達到最大值3.63 mg/g。

圖6 提取時間對提取率的影響

2.1.6 綜合分析各因素對提取率的影響 通過單因素試驗綜合分析，可知β-環糊精的量對提取率的影響最為顯著，同時在實驗過程中可以觀察到β-環糊精大大提高了女貞葉中有效成分在甲醇中的溶解度，增大了其溶解的速率，縮短了所需溶解的時間；同時在5個因素中提取的時間對其提取率的影響不大可忽略。綜合各因素的影響效果可篩選出溶劑比，料液比，試樣量與β-環糊精之比和提取溫度4個因素對提取率的影響最為顯著，可以作為自變量進行響應面法分析。

2.2 響應面法優化

2.2.1 響應面法優化實驗的結果與分析 根據響應面法實驗設計，超聲提取女貞子中三萜成分的提取率見下表2：

采用Design Expert 10.0軟件對上表中的數據進行多元線性回歸和二次多項方程擬合[9]，所得女貞葉三萜成分的提取率與溶劑比(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、試樣量與β-環糊精之比(D)二次多項回歸方程y=5.01+0.10×A+0.21×B+0.29×C+0.21×D-0.083×A×B+0.23×A×C+5.750-E003×A×D-0.20×B×C+0.11×B×D-0.13×C×D-0.60×A2-0.67×B2-0.33×C2-0.80×D2。如上所示，該回歸方程擬合效果好，失擬性不顯著，能很好地反映各因素對女貞葉中三萜類化合物提取率的影響。

表2 女貞子中三萜成分提取的響應面法優化實驗結果

表3 女貞葉三萜提取工藝響應面回歸方程系數的方差分析

注：“*”表示顯著；“**”表示不顯著

模型中F=9.93，P<0.000 1，表明實驗所采用的二次模型是極其顯著的，在統計學上是非常有意義的。說明未知因素干擾極小，因此F值是可靠的。回歸方程的決定系數R2值為0.908 5，說明有90.85%的相關性與自變量 三萜的提取率有關，所以該回歸方程能夠很好地說明各因素與響應值之間的關系，且同時有具體的數值大小進行反映。則可以用此模型對女貞子中三萜類提取實驗的結果進行預測和分析。

3 結論與討論

本次試驗利用超聲波提取法提取女貞葉中的三萜成分，探究β-環糊精對三萜成分的提取增溶作用以及最佳作用條件，首先將β-環糊精作為一個因素和其他因素一起進行單因素實驗。篩選影響效果最顯著的4組通過響應面分析法對女貞葉中三萜成分的工藝進行優化，通過四因素三水平建立單因素與響應值間的數學模型，研究結果表明最佳提取工藝條件為溶劑比為75%、料液比1∶25、試樣量與β-環糊精之比為1∶1.5 、提取溫度55 ℃，最佳提取率為5.115 30 mg/g，與預測值相差較小，因此可以得出β-環糊精能夠大大提高女貞葉中三萜的提取率，為今后三萜的工藝大量生產提供了有力的依據。女貞葉中三萜提取工藝多以齊墩果酸為評價指標，已有部分研究是關于相應面優化女貞葉中有效成分的提取工藝，但對于本實驗研究的β-環糊精對三萜成分的輔助提取作用研究工藝尚未見有所報道，本實驗采用的響應面法，避免了正交實驗的各種缺點，使優化結果的數據更加精確。