一株臨滄野生黃雞的鑒定與生長條件研究

周會明，張焱珍，柴紅梅，楊榮情，譚 瑩，張萍萍，白玉英，趙一蓮，金玉潔

(1.滇西科技師范學院 生物技術與工程學院，云南 臨滄 677000； 2.云南省農業科學院 生物技術與種質資源研究所，云南 昆明 650221)

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

1.1.2 培養基

PDA培養基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1 L，pH自然。

碳源基礎培養基：蛋白胨3 g、KH2PO40.2 g、MgSO40.1 g、瓊脂15 g、水1 L，pH自然。

氮源基礎培養基：葡萄糖20 g、KH2PO40.2 g、MgSO40.1 g、瓊脂15 g、水1 L，pH自然。

碳氮比(C/N)基礎培養基：KH2PO40.2 g、MgSO40.1 g、瓊脂15 g、水1 L、pH自然。

1.2 方法

1.2.1 子實體的采集、分離純化與培養

在云南省臨滄市芒角社區綠化帶的草坪采集到一株野生幼嫩子實體，依據其宏觀與微觀形態特征進行初步鑒定；在PDA培養基上，采用菌肉組織分離法，經25 ℃下遮光培養獲得純培養物，編號為LCT10。

1.2.2 ITS序列分析

菌株在PDA培養基上25 ℃培養10 d，采用CTAB法[11]提取野生菌株LCT10菌絲體DNA，用通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGG-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)擴增ITS片段[12]。PCR產物在昆明碩擎生物科技有限公司進行序列測定。將測得的ITS序列通過NCBI在線BLASTN檢索，與GenBank中的ITS基因序列進行同源性比較，然后利用ClustalX軟件對所得序列進行多序列聯配分析，并使用MEGA4.0軟件構建系統進化樹，計算遺傳距離[13]。

1.2.3 菌絲體的活化

1.2.4 溫度試驗

在PDA培養基平板中央接入直徑為5 mm的菌塊，在溫度梯度5、10、15、20、25、30 ℃分別連續恒溫黑暗培養22 d，每溫度處理3次重復。采用多次十字交叉法測定菌落直徑，依據生長時間(d)計算菌絲生長速度(mm·d-1)，根據菌絲濃密程度記錄生長勢[15]。

1.2.5 pH試驗

用1 mol·L-1HCl或1 mol·L-1NaOH調節PDA培養基pH至4、5、6、7、8、9、10、11、12。在不同pH的平板中央接入直徑5 mm的菌塊餅各1塊，3個重復，在(25±3)℃黑暗培養20 d。菌落直徑、菌絲生長速度、生長勢測定方法同1.2.4節。

1.2.6 光照試驗

1.2.7 通氣性試驗

接種后于25 ℃恒溫黑暗連續培養20 d，培養期間共分成處理1(不處理)、處理2(每隔10 d在酒精燈火焰下通風5 s)、處理3(每隔5 d在酒精燈火焰下通風5 s)及處理4(每隔1 d在酒精燈火焰下通風5 s)4組處理，每處理3個重復。菌落直徑、菌絲生長速度、生長勢測定方法同1.2.4節。

1.2.8 碳氮源試驗

在碳源基礎培養基上，分別用2%的蜂蜜、可溶性淀粉、玉米粉、蔗糖代替葡萄糖做碳源試驗；同樣的方法，分別用0.3%的尿素、甘氨酸、硝酸銨代替蛋白胨做氮源試驗。菌落直徑、菌絲生長速度、生長勢測定方法同1.2.4節。

1.2.9 C/N試驗

在C/N基礎培養基上，以葡萄糖為碳源，甘氨酸為氮源，配制C/N分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1的6種培養基。菌落直徑、菌絲生長速度、生長勢測定方法同1.2.4節。

1.3 統計方法

試驗數據均用SPSS 19.0軟件進行統計分析[16]。

2 結果與分析

2.1 野生菌株LCT10子實體形態特征

2.2 基于ITS序列系統發育分析

2.3 溫度對黃雞菌絲生長的影響

2.4 pH對黃雞菌絲生長的影響

2.5 光照對黃雞菌絲生長的影響

圖1 野生黃雞子實體

圖2 基于ITS序列的黃雞與其他雞菌屬種的鄰接法系統發育分析(1 000次重復)

數據為菌絲生長速度的3次重復的平均值和標準差。柱上無相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，柱上無相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。菌絲生長勢：+++表示濃密，++表示較濃密，+表示稀疏；-表示不生長。下同。Values represent of 3 replicates of mycelial growth rate. Data on the bars marked without the same uppercase letter indicated significant differences at P<0.01， Data on the bars marked without the same lowercase letter indicated significant differences at P<0.05. “+++”indicated that mycelia grew vigorously， “++”indicated that mycelia grew ordinarily， “+” indicated that mycelia grew weakly， “-”indicated that mycelia didn’t grow. The same as below.

2.6 通氣性對黃雞菌絲生長的影響

2.7 碳源對黃雞菌絲生長的影響

2.8 氮源對黃雞菌絲生長的影響

2.9 碳氮比(C/N)對黃雞菌絲生長的影響

圖4 pH對黃雞菌絲生長的影響

圖5 光照強度對黃雞菌絲生長影響的比較

3 結論與討論

圖6 通氣性對黃雞菌絲生長的影響

圖7 碳源對黃雞菌絲生長影響的比較

圖8 氮源對黃雞菌絲生長影響的比較

圖9 碳氮比對黃雞菌絲生長影響的比較