四川地區豬源致病性大腸埃希菌分子分群、生物被膜形成能力及耐藥性研究

彭珂楠，周雪珂，殷鑫歡，李 飛，蔡 瑤，曾喻兵，江朝源，張儒博，楊澤曉，徐志文，3，朱 玲，3，*

(1.四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130； 2.四川大學 生命科學學院，四川 成都 610044； 3.四川農業大學 動物疫病與人類健康四川省重點實驗室，四川 成都 611130)

大腸埃希菌(Escherichiacoli)是一種能引起人畜共患病的革蘭氏陰性短桿菌，普遍存在于自然環境中，通過各種途徑對畜禽養殖業、食品、水域環境造成嚴重的污染和經濟損失[1]。豬大腸桿菌病是由致病性大腸埃希菌引起的仔豬腸道傳染病，常見的有仔豬黃痢、仔豬白痢和仔豬水腫病3種，以發生腸炎、腸毒血癥為特征[2]。實際生產中，常使用抗生素來治療大腸桿菌病[3]，由于大腸埃希菌易產生耐藥性，尤其近年來抗菌藥物的廣泛使用，使耐藥菌株不斷增加[3-4]，嚴重影響養殖業的發展。

細菌生物被膜(bacterial biofilms，BF)是指由細菌自身分泌的多聚基質包裹、能黏附于某種有生命或無生命固體表面的細菌聚集膜樣物[5]，能增加細菌定植能力、感染力，提高其對抗生素的耐受性和耐藥性。高致病性毒力島(high pathogenicity island，HPI)最初發現于耶爾森菌中，可在耶爾森菌、大腸埃希菌及沙門氏菌間水平傳播[6-8]，是決定細菌致病性和毒力的重要因素之一。HPI毒力島的主要結構基因包括irp1、irp2和fyuA基因，irp2基因作為鐵調節基因，僅存在于強致病株中，與細菌毒力密切相關。由于irp2基因核苷酸序列具有高度保守性，成為用來判斷和檢測病原菌是否存在HPI毒力島的標志基因[9-10]。

本試驗自2016年至2018年間從四川地區不同養殖場的患病豬體內分離到22株致病性大腸埃希菌，并對其進行分子分群、耐藥性和BF形成能力研究，同時對耐藥基因類型及3種HPI毒力島基因攜帶情況進行檢測分析，以期進一步了解四川省豬源致病性大腸埃希菌的分子流行特點，為四川地區豬致病性大腸埃希菌的有效防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2016—2018年，從四川地區不同養豬場出現消瘦、腹瀉、水腫甚至死亡的病豬中，無菌采集肝臟、脾臟、肺臟、腸道等組織樣品208份。

1.1.2 主要試劑及試驗動物

LB肉湯、麥康凱培養基、MH瓊脂培養基、藥敏紙片購自四川瑞進特科技有限公司；2×TaqPCR Master Mix、DL2000 DNA Maker、ddH2O購自寶生物工程(大連)有限公司；細菌DNA提取試劑盒購于TIANGEN公司；8周齡的健康BALB/c小鼠購自達碩公司。

1.2 材料

1.2.1 細菌分離鑒定

樣品接種麥康凱培養基，37 ℃培養箱中培養12 h后，觀察菌落形態，挑取可疑單個菌落接種于營養肉湯中進行純化培養，37 ℃搖床振蕩培養12 h，所有分離株經革蘭染色后鏡檢、生化鑒定和16S rRNA分析鑒定。分離株保存在終濃度30%的甘油肉湯中，-20 ℃冰箱保存備用。

1.2.2 致病性試驗

6只健康小鼠隨機分為2組，第1組注射大腸埃希菌菌液，第2組注射生理鹽水。挑取單菌落37 ℃、150 r·min-1振蕩培養過夜，4 ℃、5 000 r·min-1離心5 min收集菌體，用無菌生理鹽水懸浮菌體，試驗組小鼠腹腔注射0.2 mL(6×108CFU·mL-1)菌液，對照組腹腔注射等量生理鹽水。觀察并記錄小鼠臨床表現及死亡情況，剖檢死亡小鼠，并分離細菌。

1.2.3 耐藥試驗

將22株分離菌以LB肉湯稀釋至0.5麥氏單位，用紙片擴散法檢測被檢菌株對左氧氟沙星、諾氟沙星、恩諾沙星、新霉素、丁胺卡那、慶大霉素、鏈霉素、大觀霉素、頭孢曲松、氨芐西林、阿莫西林、頭孢吡肟、頭孢噻肟、紅霉素、氟苯尼考、復方新諾明、多粘菌素B、四環素、多西環素等19種抗菌藥的敏感性，按照美國臨床和實驗室標準協會(clinical and laboratory standards institute，CLSI)標準進行結果判定。

1.2.4 生物被膜的形成

參考文獻[11]，采用結晶紫微孔板法對分離菌株進行生物被膜的定量檢測，每株菌株設4個平行孔，置于酶標儀上檢測595 nm下的吸光度值，重復檢測3次，取平均值。以陰性對照孔吸光度值的2倍作為判斷能否形成生物被膜的臨界點Dc。當D≤Dc時，表示細菌形成生物被膜能力為零；當Dc2Dc時，表示細菌形成生物被膜的能力較強。

1.2.5 系統進化分群分析

參考文獻[12]方法進行分子分群，設計3對大腸埃希菌分群引物(表1)，采用多重PCR方法對分離菌株進行分群鑒定，用1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統拍照記錄結果。

1.2.6 分離菌株耐藥基因及毒力基因檢測

根據文獻[1]，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成耐藥基因TEM、SHV、OXA、sulⅠ、sulⅡ、acc(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅱ、cmlA、floR、tetA、tetB、qurB及HPI毒力島基因irp1、irp2、fyuA引物序列(表2)。以22株致病性大腸埃希菌分離株基因組DNA為模板對12種耐藥基因及3種HPI毒力島基因進行PCR擴增，每個基因分別取1株進行膠回收并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測序結果與GenBank數據庫相應序列進行同源性對比。

2 結果與分析

2.1 大腸埃希菌分離鑒定結果

無菌采集患病豬組織病料進行細菌分離鑒定，結果顯示，87株分離菌株在麥康凱培養基上為邊緣淺紅色中心深桃紅色，圓形扁平菌落，邊緣整齊，表面光滑濕潤；經革蘭染色及鏡檢可見其形態為單個存在的陰性兩端鈍圓的桿狀菌；生化試驗發現試驗菌株可以發酵乳糖和山梨醇，吲哚和甲基紅試驗均為陽性，乙酰甲基甲醇試驗和枸櫞酸鹽利用試驗陰性，氧化酶試驗和硫化氫試驗陰性，均符合大腸埃希菌的特點；16S rRNA檢測結果可獲得1 500 bp的目的條帶，經過測序比對均確認為大腸埃希菌。

表1 引物信息

Table1Primers information

檢測基因Gene引物序列Primersequences(5′-3′)基因登錄號GenBankaccessionNo.產物大小Productsize/bpChuAF:GACGAACCAACGGTCAGGAT;R:TGCCGCCAGTACCAAAGACAU67920.1279YjaAF:TGAAGTGTCAGGAGACGCTG;R:ATGGAGAATGCGTTCCTCAACMH511178.1211TspE4.C2F:GAGTAATGTCGGGGCATTCA;R:CGCGCCAACAAAGTATTACGMH511180.1152

表2 引物信息

Table2Primers information

基因類型Genotype基因Gene引物序列Primersequences(5′-3′)基因登錄號GenBankaccessionNo.產物大小Productsize/bpβ-內酰胺類TEMF:ACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCC;R:ACCCACTCGTGCACCCAACTGFJ668751118β-LactamSHVF:GCGACAACGTCACCCGCCTT;R:TTGCGAACGGGCGCTCAGACFJ668798132OXAF:ACAGAAGCATGGCTCGAAAGT;R:TTGCTGTGAATCCTGCACCAGQ896560190磺胺類sulⅠF:TCGGACAGGGCGTCTAAG;R:GGGTATCGGAGCGTTTGCAM295981925SulfonamidessulⅡF:TGCCATCCCTGGTCAGAGTGCAG;R:GCAGTCAATGGGCGCAAGCTGTFJ705354179氨基糖苷類Acc(3)-ⅡF:GGCGACTTCACCGTTTCT;R:GGACCGATCACCCTACGAGX13543412Amimoglycosidesaph(3′)-ⅡF:CGTATTTCGTCTCGCTCAG;R:GATTCCGACTCGTCCAACNC009656232氯霉素類cmlAF:GGGTGGCGGGCTATCTTT;R:GCGACACCAATACCCACTAGAJ487033467ChloramphenicolfloRF:GAACACGACGCCCGCTAT;R:TTCCGCTTGGCCTATGAGDQ206638601四環素類tetAF:TTGGCATTCTGCATTCACTCG;R:CCACCCGTTCCACGTTGTTX75761344TetracyclinestetBF:TTCACCGCATAGTCCCTT;R:TGCAATAAATCCGAGCAGV00611388喹諾酮類qurBF:CTATGATCGTGAAAGCCAGAAAGG;NC010943427QuinolonesR:CCGAATATCTAAGTCACCCAACTCCHPI毒力基因irp1F:CCGGTTATTGTGAAGGTT;R:GTGAATGTTACGGCACTAAY12527799HPIvirulenceirp2F:AAGGATTCGCTGTTACCGGAC;R:AACTCCTGATACAGGTGGCL18881414genesfyuAF:GCTTTATCCTCTGGCCTT;R:GGCATATTGACGATTAACGZ35486948

2.2 致病性試驗結果

試驗組小鼠在接種大腸埃希菌分離株24～48 h后，出現了精神沉郁、食欲減退等癥狀，逐漸出現死亡。剖檢死亡小鼠進行細菌分離鑒定，從小鼠的肝臟中分離到大腸埃希菌，對照組小鼠未出現明顯的變化。通過致病性試驗統計與分析，共篩選出22株致病性大腸埃希菌。

2.3 藥敏試驗結果

大腸埃希菌藥敏試驗結果見表3。由表可知，22株大腸埃希菌對阿莫西林、紅霉素、四環素、復方新諾明、恩諾沙星、氨芐西林、氟苯尼考、多西環素、鏈霉素有較強的耐藥性，耐藥率均在80%以上；對左氧氟沙星、諾氟沙星、慶大霉素、頭孢曲松4種藥物的耐藥率為63.64%～72.73%；對新霉素、頭孢噻肟、大觀霉素、丁胺卡那、頭孢吡肟、多粘菌素B的耐藥率低于60%，表現出不同程度的敏感性。

2.4 生物被膜形成能力

利用結晶紫染色定量法測定分離的大腸埃希菌生物被膜形成能力，結果顯示，22株大腸埃希菌分離株有16株可以形成生物被膜，占分離菌總數的72.73%，其中強成膜能力菌株9株，弱成膜能力菌株7株。

2.5 系統進化分群分析結果

據文獻[12]所建立的方法，對22株豬源致病性大腸埃希菌進行分群鑒定。如圖1所示，A群大腸埃希菌比例為59.09%(13/22)，B1群大腸埃希菌比例為4.55%(1/22)，B2群大腸埃希菌比例為22.73%(5/22)，D群大腸埃希菌比例13.64%(3/22)。

2.6 耐藥基因及HPI毒力島基因檢測結果

22株豬源致病性大腸埃希菌TEM、SHV、OXA、sulⅠ、sulⅡ、acc(3)-Ⅱ、aph(3′)-Ⅱ、cmlA、floR、tetA、tetB、qurB等12種耐藥基因及irp1、irp2、fyuA等3種HPI毒力島基因凝膠電泳成像結果見圖2。結果顯示，15種基因片段大小與目的條帶大小一致。從檢出的耐藥基因型中各取1份陽性PCR擴增產物進行序列測序，測序結果與GenBank收錄的對應基因序列同源性均在98%以上。耐藥基因及HPI毒力島基因攜帶情況見表4。

表3 大腸埃希菌藥敏試驗結果

Table3Drug sensitive results ofEscherichiacoliisolates

抗菌素Antibiotics耐藥Resistant菌株數No.所占比例Proportion/%中介Intermediary菌株數No.所占比例Proportion/%敏感Senstive菌株數No.所占比例Proportion/%喹諾酮類Quinolones左氧氟沙星Levofloxacin1672.7300627.27諾氟沙星Norfloxacin1672.7314.55522.73恩諾沙星Enrofloxacin1986.36313.6400氨基糖苷類Amimoglycosides新霉素Neomycin1254.55418.18627.27丁胺卡那Amikacin627.27313.641359.09慶大霉素Gentamicin1568.1800731.82鏈霉素Streptomycin1881.8229.0929.09大觀霉素Spectinomycin836.36313.641150β-內酰胺類β-Lactam頭孢曲松Ceftriaxone1463.64313.64522.73氨芐西林Ampicillin1986.3600313.64阿莫西林Amoxicillin22100.000000頭孢吡肟Cefepime627.27418.181254.55頭孢噻肟Cefotaxime1254.55940.9114.55大環內酯類Macrolide紅霉素Erythrocin22100.000000氯霉素類Chloramphenicol氟苯尼考Florfenicol1986.3614.5529.09磺胺類Sulfonamides復方新諾明Selectrin2090.9129.0900脂肽類Daptomycin多粘菌素BPolymyxinB14.55940.911254.55四環素類Tetracyclines四環素Tetracycline2195.4514.5500多西環素Doxycycline1986.36313.6400

M，DL 2 000 marker；1、8、11-22，A群；14，B1群；2-6，B2群；7、9、10，D群。M， DL 2 000 marker；1, 8, 11-22: A group; 14， B1 group; 2-6， B2 group; 7, 9, 10: D group.

M，DNA Maker DL 2000；1-15:基因1，OXA基因；2，sul Ⅰ基因；3，tetA基因；4，acc(3)-Ⅱ基因；5，aph(3’)-Ⅱ基因；6，cmlA基因；7，floR基因；8，irp2基因；9，qnrB基因；10，fyuA基因；11，irp1基因；12，tetB基因；13，sul Ⅱ基因；14，SHV基因；15，TEM基因。M， DNA Maker DL 2000; 1， OXA gene; 2， sul Ⅰ gene; 3， tetA gene; 4， acc(3)-Ⅱ gene; 5， aph(3’)-Ⅱ gene; 6， cmlA gene; 7， floR gene; 8， irp2 gene; 9， qnrB gene; 10， fyuA gene; 11， irp1 gene; 12， tetB gene; 13， sul Ⅱ gene; 14， SHV gene; 15， TEM gene.

表4 大腸埃希菌耐藥基因及HPI毒力島基因檢出結果

Table4Detection of resistant genes and HPI virulence genes inEscherichiacolifrom swine

抗菌素Antibiotics基因Gene陽性菌株數Numberofpositivestrains陽性檢出率Positiverate/%β-內酰胺類β-LactamTEM836.36SHV29.09OXA29.09氨基糖苷類Amimoglycosidesacc(3)-Ⅱ1568.18aph(3’)-Ⅱ1150.00磺胺類SulfonamidessulⅠ1463.64sulⅡ2195.45氯霉素類ChloramphenicolcmlA1045.45floR1881.82四環素類TetracyclinestetA1881.82tetB1986.36喹諾酮類QuinolonesqnrB940.91HPI毒力島基因HPIvirulencegenesirp1940.91irp2313.64fyuA313.64

結果顯示，22株豬源致病性大腸埃希菌中，磺胺類耐藥基因sulⅡ，四環素類耐藥基因tetA、tetB，氯霉素類耐藥基因floR攜帶率均高于80%；氨基糖苷類耐藥基因acc(3)-Ⅱ，磺胺類耐藥基因sulⅠ攜帶率也較高；β-內酰胺類耐藥基因TEM、SHV、OXA，氨基糖苷類耐藥基因aph(3’)-Ⅱ，氯霉素類耐藥基因cmlA，喹諾酮類耐藥基因qnrB攜帶率相對較低。HPI毒力島基因irp1、irp2、fyuA攜帶率分別為40.91%、13.64%、13.64%。

3 討論

大腸埃希菌可分為A、B1、B2和D共4個群，B2和D群是主要的腸道外致病大腸埃希菌[13-14]。李金朋等[15]研究顯示，河南地區致病性大腸埃希菌分離菌多屬于B2、D致病群；胡林等[16]對華東部分地區禽致病性大腸埃希菌進行研究發現，分離菌主要分布于A、B1群。本研究對四川地區分離的22株致病性大腸埃希菌進行分子分群及生物被膜形成能力分析，其中A群所占比例最大，B2群次之，與河南、華東地區的研究結果有所差異。大腸埃希菌生物被膜形成陽性率為72.73%，其中強成膜能力菌株占40.91%，總體陽性率所占比例較高，這一結果可能與分離株較強的耐藥性有關，但具體關聯還需進一步分析。

22株致病性大腸埃希菌對四環素類、喹諾酮類等抗生素耐藥最普遍，對頭孢類、丁胺卡那及多粘菌素B等抗生素較為敏感，其中有2株對除多粘菌素B之外的所有抗生素均耐藥，其他菌株對19種抗生素均有不同程度的多重耐藥性，此耐藥情況與國內其他地區大腸埃希菌耐藥情況相似[4，17-18]。

細菌產生耐藥性的原因有很多，通常與細菌本身特性、耐藥性基因的傳播和藥物的常規使用情況等因素有很大關系[19]。四環素類、磺胺類、氨基糖苷類、β-內酰胺類等抗生素藥物是獸醫臨床常用藥物，不合理添加及無限制地濫用使得大腸埃希菌耐藥基因不斷出現，且有越來越嚴重的發展趨勢。

本試驗從分離的22株豬源致病性大腸埃希菌中檢測出12種不同類型的耐藥基因型，其中四環素類耐藥基因tetA、tetB的檢出率均較高，表明這2種耐藥基因在四川地區豬源致病性大腸埃希菌中普遍存在，與國內其他地區的研究結果相似[4，17]，且四環素類耐藥基因tetA、tetB的檢出率也與菌株對四環素類抗生素的耐藥率相符合，這一定程度上也反映出了耐藥基因型與耐藥表型之間的相關性。磺胺類耐藥基因sulⅠ、sulⅡ的檢出率也相對較高，與菌株對磺胺類抗生素藥物復方新諾明的高耐藥率表型也相符合。根據寇宏等[20]、翟晶[21]的研究報道，貴州省、浙江省豬源大腸埃希菌sulⅠ、sulⅡ耐藥基因的檢出情況較為嚴重，表明我國磺胺類耐藥基因攜帶率較高。氨基糖苷類耐藥基因acc(3)-Ⅱ、aph(3’)-Ⅱ的耐藥率分別為68.18%、50.00%，與河南地區的相關檢測數據一致性很高[4]，低于陳琳等[22]對豬腸道中氨基糖苷類耐藥基因acc(3)-Ⅱ、aph(3’)-Ⅱ的檢出率。本試驗中，豬源大腸埃希菌氯霉素類耐藥基因floR的檢出率最高，其次是cmlA，這一結果與坤清芳等[23]研究的四川地區兔源大腸埃希菌floR的檢出率結果相差較大，表明即使在同一地區，不同來源的大腸埃希菌耐藥基因的攜帶情況也有顯著差異。喹諾酮類耐藥基因qnrB檢出率為40.91%，與閩西地區豬源大腸埃希菌喹諾酮類耐藥基因qnrB檢出率(37.8%)相似[24]，明顯高于犬源大腸埃希菌喹諾酮類耐藥基因的檢出率[25]，這一現象可能是由于喹諾酮類抗生素藥物廣泛添加到食品動物生產養殖中。β-內酰胺類耐藥基因TEM、SHV、OXA檢出率較低，與河南地區豬源大腸埃希菌β-內酰胺類耐藥基因的檢出率差異較大[4]，河北地區雞源大腸埃希菌β-內酰胺類耐藥基因OXA攜帶率相似[26]。細菌耐受某種抗菌藥物常常與其攜帶一種或多種耐藥基因有關，所以耐藥基因的檢出率與其耐藥表型之間存在一定的差異。四川地區豬源致病性大腸埃希菌的耐藥基因型復雜，呈多重基因型共存。

相關研究表明，HPI毒力島在我國養殖場大腸埃希菌分離株中普遍存在[27]。本試驗中，HPI毒力島基因irp1、irp2、fyuA檢出率分別為40.91%、13.64%、13.64%，其中3株大腸埃希菌同時攜帶irp1、irp2、fyuA等3種HPI毒力島基因及多種耐藥基因。菌株同時攜帶多種毒力基因和耐藥基因，可能使得其引發的疾病更加難以預防和治療，對畜禽及人類造成的危害更加嚴重，應引起重視。