淀粉誘導奶牛乳脂下降后奶牛瘤胃細菌菌群變化

徐曉鋒，郭 成

(寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021)

隨著奶牛養殖業向集約化、高效化發展，許多養殖場通過提高精飼料濃度來滿足高產奶牛的能量需求，提高奶牛的生產性能。研究表明，在飼料中適當添加精制玉米淀粉，可以增加瘤胃中碳水化合物水平，提高泌乳中期奶牛的生產性能[1]。然而，在現代奶牛生產中，為了追求更高的經濟效益，生產者往往會給奶牛飼喂過多的高精飼糧。由于高精飼料富含淀粉，且淀粉在瘤胃中能迅速地分解釋放出大量的揮發性脂肪酸，使得瘤胃酸性迅速下降。當奶牛飼料中谷物含量達到30%～40%時，瘤胃內易發酵碳水化合物急劇上升并迅速轉化為葡萄糖，淀粉與葡萄糖降解釋放出大量的揮發酸，使瘤胃酸度迅速下降[2]。在奶牛生產中給奶牛飼喂谷物含量較高的飼料后，瘤胃內谷物迅速發酵，產生一系列異常的、有毒的、致炎性的代謝物，直接對奶牛的健康造成威脅或潛在威脅[3]。

飼喂高精飼料會對奶牛瘤胃菌群產生影響。Dehority等[4]研究表明，當飼喂高纖維飼料時，瘤胃纖維降解菌的濃度顯著增加。楊宏波等[5]研究不同精粗比飼料對斷奶公犢牛瘤胃微生物的影響，發現高精飼料阻礙了奶牛瘤胃纖維降解菌的生長。Belanche等[6]對比了粗飼料和高精飼料飼喂的羔羊，發現飼喂粗飼料的羔羊瘤胃中有更多的產琥珀酸絲狀桿菌，厭氧真菌和細菌菌群的多樣性也更多。隨著日糧中精飼料比例的增加，瘤胃纖維降解菌的生長會受到抑制[7]。過高比例的精飼料還會導致牛奶中脂肪酸組成發生改變，導致乳脂率下降。曹洋等[8]研究表明，高精飼料導致奶牛肝臟脂肪酸合成代謝減弱而分解代謝增強，肝臟內乳脂前體物發生重分配，乳脂前體物輸出減少，影響了乳脂合成。乳脂率易受營養因素影響，乳脂降低綜合征[9]的奶牛日糧大多都有纖維素含量低、瘤胃易發酵碳水化合物含量高的特點[10]。本試驗以泌乳期奶牛為研究對象，使用玉米淀粉誘導奶牛乳脂降低，研究其對奶牛瘤胃菌群的影響，為高精飼料導致的奶牛乳脂下降的日糧瘤胃發酵調控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

玉米淀粉由寧夏農墾賀蘭山奶業公司提供。

1.2 試驗動物與飼糧

試驗于寧夏回族自治區銀川市西夏區寧夏某奶牛場進行。選取同一個圈舍體況良好、體質量相近、胎次相同、產奶量接近的泌乳期中國荷斯坦奶牛4頭作為試驗動物。根據NRC(2001)奶牛飼養標準配制基礎日糧，基礎日糧組成和營養成分見表1。試驗動物采用全混合日糧(TMR)飼喂方式，日投料3次，自由采食，全天自由飲水。

表1 基礎日糧組成及營養水平(干物質基礎)

Table1Composition and nutrient levels of the basal diet (DM basis) %

項目Items含量Content原料Ingredients 豆粕Soybeanmeal11.30 菜籽粕Rapeseedmeal3.20 全棉籽Wholecottonseed3.50 麩皮Wheatbran3.18 壓片Tabletcorn11.06 甜菜顆粒Beetgranule2.49 啤酒糟Brewer sgrains3.16 苜蓿青貯Alfalfasilage4.12 苜蓿Alfalfa10.32 玉米青貯Cornsilage45.06 碳酸氫鈣Dicalciumphosphate0.62 石粉Limestone0.39 小蘇打Bakingsoda0.30 氧化鎂Magnesiumoxide0.50 食鹽Salt0.30 脫霉素Demycin0.10 預混料Premix0.40合計Total100.00營養水平Nutritionlevels 粗蛋白CP17.14 鈣Ca0.76 磷P0.46 中性洗滌纖維NDF35.78 淀粉Corn24.25 產奶凈能NE1)L/(MJ·kg-1)6.00

1)產奶凈能為計算值，其他為實測值。

1)NELwas a calculated value， while the others were measured values.

1.3 試驗設計

參考朱河水等[11]方法，采用自身對照試驗設計。試驗開始前以基礎日糧飼喂奶牛，預飼3 d，以減少奶牛應激；之后繼續以基礎日糧飼喂并作為對照(CK)，飼喂7 d；試驗期每頭奶牛日糧中添加1.5 kg·d-1玉米淀粉，飼喂15 d，作為試驗組(C)。添加玉米淀粉時，參考Weimer等[12]方法，使飼糧中淀粉營養水平達到27%。玉米淀粉每日添加2次，每次添加750 g，以灌服方式添加，保證奶牛每日添加的淀粉完全采食。

1.4 樣品采集與處理

1.4.1 瘤胃液采集

使用負壓吸取裝置(自行設計)，通過奶牛口腔釆集瘤胃液。采集的時間分別為飼喂前(0 h)及飼喂后2、4、6 h，每次取樣50 mL。為獲得具有代表性的樣品，每天4個時間點所取的瘤胃內容物樣品經混勻后各取5 mL，充分混合，轉入凍存管置液氮臨時保存，轉移到試驗室-80 ℃冰箱保存。

1.4.2 牛奶采集

試驗牛每日清晨固定時間采奶，每次擠奶取2個奶樣，各50 mL，奶樣來自4個乳區，混合后直接測定牛奶成分。

1.4.3 瘤胃液DNA提取

取2 mL瘤胃液，采用試劑盒法提取瘤胃微生物DNA，試劑盒采購于南京建成生物研究所。每頭牛每個時間段瘤胃液取3管樣品，即3個重復。

1.4.4 PCR擴增

PCR擴增前用瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA樣品的純度和濃度，于離心管中取適量的樣品進行稀釋。將稀釋后的基因組DNA作為模板。瘤胃液DNA擴增目的片段為V3+V4區，引物序列為341F: 5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′；806R: 5′-GGACTACHVGGGTATCTAAT-3′[13]。

1.4.5 PCR產物的混樣與純化

PCR產物使用膠濃度為2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測；依照PCR產物濃度的檢測結果進行等濃度混樣，充分混勻后使用膠濃度為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，使用南京建成生物研究所提供的回收試劑盒回收產物。

1.4.6 Hiseq測序

將樣品送至廣州基迪奧生物科技有限公司進行Hiseq測序，采用Hiseq 2500 PE 250平臺，數據由平均值和標準誤表示，以P<0.05作為差異顯著性判定標準。

2 結果與分析

2.1 添加淀粉對牛奶成分的影響

由表2可見，在添加淀粉后，牛奶中乳脂率極顯著降低(P<0.01)，但是乳蛋白率和乳糖率沒有顯著影響。

2.2 奶牛瘤胃細菌菌群結構分析

2.2.1 瘤胃細菌菌群OTUs比較

經Illumina Hiseq測序結束后，除去低質量序列，通過序列拼接，應用Mothur根據97%的序列相似度，對序列進行OTU聚類，對樣品進行OTU的統計，剔除稀有OTU后對照組樣品獲得2 900個，試驗組樣品獲得2 931個，樣品間差異不顯著(P>0.05)，2個樣品共享OTU為2 472個(圖1)。

2.2.2 瘤胃細菌alpha多樣性分析

基于OTU結果，計算樣品的alpha多樣性，如表3所示。飼喂玉米淀粉奶牛瘤胃細菌菌群的Chao1值、Ace值、Shannon指數和Simpson指數與對照組均無顯著差異(P>0.05)，說明飼喂玉米淀粉對瘤胃細菌多樣性和種類分布均勻度均無顯著影響。本試驗的瘤胃液樣品的Shannon曲線見圖2(每個樣本3個重復)。如圖所示，當測序深度超過12 500 reads時，曲線趨于平緩，各樣品達到飽和狀態，表明本試驗的測序深度足以覆蓋各樣品中大多數微生物。

表2 添加淀粉對牛奶成分的影響

Table2Effect of adding starch on milk fat of dairy cow %

項目Item對照組Controlgroup(CK)試驗組Experimentalgroup(C)乳脂率Fatrate/%4.05A2.40B乳蛋白率Proteinrate/%3.25a3.35a乳糖率Lactose/%4.95a5.05a

同行數據后沒有相同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，沒有相同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

In the same row， values with different small letters showed significant difference (P<0.05)， and with different capital letters showed extremely significant difference (P<0.01).

圖1 玉米淀粉對瘤胃細菌菌群基因OTU分布的影響

2.2.3 奶牛瘤胃細菌在門水平上的結構變化

表4為玉米淀粉對瘤胃菌群的影響，只列出部分結構變化較大或者占總菌群比例較多的菌門，共涉及28個門。由表可知，厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)占總菌群比例的90%。與對照組相比，玉米淀粉導致瘤胃芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、軟壁菌門(Tenericutes)豐度極顯著降低(P<0.01)，裝甲菌門(Armatimonadetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、藍藻門(Cyanobacteria)豐度顯著降低(P<0.05)，厚壁菌門(Firmicutes)豐度顯著增加(P<0.05)；放線菌門(Actinobacteria)豐度有增加趨勢(P<0.1)。

表3 樣品在0.03距離下的Alpha豐富程度表

Table3Alpha richness table of samples at the distance of 0.03

項目ItemLabelChao1值Chao1valueAce值AcevalueShannon指數ShannonindexSimpson指數Simpsonindex覆蓋率Coverage/%對照組Controlgroup(CK)0.033866.473780.217.960.9899.29試驗組Experimentalgroup(C)0.033894.403810.998.390.9799.29P-value—0.930.810.130.25—

圖2 玉米淀粉對瘤胃細菌菌群基因Shannon指數的影響

2.2.4 奶牛瘤胃細菌在屬水平上的結構變化

本試驗中，奶牛瘤胃液菌群總共涉及383個菌屬，其中90個菌屬差異顯著(P<0.05)，表5只列出部分結構變化較大或者占總菌群比例較多的菌屬。由表可知，瘤胃菌科UCG-014菌屬(Ruminococcaceae UCG-014)、葡萄球菌屬(Staphylococcus)、腸球菌屬(Enterococcus)、瘤胃球菌屬-2(Ruminococcus-2)、克里斯滕森菌科R-7菌屬(Christensenellaceae R-7)、魏斯氏菌屬(Weissella)、普雷沃氏菌屬-1(Prevotella-1)豐度較高，其中Ruminococcaceae UCG-014豐度極顯著增加(P<0.01)，魏斯氏菌屬(Weissella)豐度顯著增加(P<0.05)；腸球菌屬(Enterococcus)豐度極顯著降低(P<0.01)，葡萄球菌屬(Staphylococcus)豐度顯著降低(P<0.05)，其他優勢菌屬變化不顯著。其他菌屬如醋酸桿菌屬(Acetobacter)、氨基酸球菌屬(Acidaminococcus)、乳酸桿菌屬(Lactobacillus)、小球菌屬(Pediococcus)、明串珠菌屬(Leuconostoc)、毛螺旋菌屬-1(Lachnoclostridium-1)、瘤胃球菌屬-1(Ruminococcus-1)、普雷沃氏菌屬-7(Prevotella-7)、假丁酸弧菌屬(Pseudoscardovia)、羅斯氏菌屬(Roseburia)等豐度極顯著增加(P<0.01)，乳酸乳球菌(Lactococcus)等豐度顯著增加(P<0.05)，厭氧弧菌屬(Anaerovibrio)、腸球菌屬(Enterococcus)、棲水菌屬(Enhydrobacter)等豐度極顯著降低(P<0.01)，芽孢桿菌屬(Bacillus)、泛菌屬(Pantoea)等豐度顯著降低(P<0.05)。

表4 添加玉米淀粉在門水平上對奶牛瘤胃菌群豐度的影響

Table4Effect of adding starch on rumen flora structure at phylum level

門Phylum對照組Controlgroup(CK)/%試驗組Experimentalgroup(C)/%P-value芽單胞菌門Gemmatimonadetes0.0007±0.000600.0019軟壁菌門Tenericutes0.6040±0.10130.2933±0.01950.0040裝甲菌門Armatimonadetes0.0035±0.00060.0017±0.00040.0190厚壁菌門Firmicutes35.5208±2.924243.8389±1.76850.0170酸桿菌門Acidobacteria0.0006±0.00030.0001±0.00010.0385藍藻門Cyanobacteria0.3855±0.06310.2342±0.04080.0500放線菌門Actinobacteria0.4421±0.07520.8671±0.21210.0609未注釋菌門Bacteria-NA0.0649±0.00820.0497±0.00300.1179廣古菌門Euryarchaeota0.1763±0.03700.1058±0.02110.1039變形菌門Proteobacteria7.5804±4.04050.9094±0.11120.1329迷蹤菌門Elusimicrobia0.0117±0.00290.0092±0.00220.5225疣微菌門Verrucomicrobia0.8648±0.11710.7388±0.12850.4695擬桿菌門Bacteroidetes51.9058±5.561150.6371±1.84050.8432

表5 添加玉米淀粉在屬水平上對奶牛瘤胃菌群豐度的影響

Table5Effect of adding starch on rumen flora structure at genus level

屬Genus對照組Controlgroup(CK)/%試驗組Experimentalgroup(C)/%P-value醋酸桿菌屬Acetobacter0.0014±0.00040.0275±0.00540.0010氨基酸球菌Acidaminococcus00.0046±0.00170.0010厭氧弧菌屬Anaerovibrio0.0500±0.00620.0238±0.00360.0010腸球菌屬Enterococcus4.8775±1.40990.1867±0.03470.0010毛螺旋菌-1Lachnoclostridium-10.0191±0.00310.1076±0.01620.0010乳酸桿菌屬Lactobacillus0.3810±0.08862.3674±0.37750.0010小球菌屬Pediococcus0.0210±0.00440.0993±0.02720.0010瘤胃菌科UCG-014菌屬RuminococcaceaeUCG-0141.0878±0.16992.2126±0.29400.0010瘤胃球菌屬-1Ruminococcus-10.1215±0.00780.2772±0.03850.0010棲水菌屬Enhydrobacter0.0300±0.01430.0004±0.00010.0020明串珠菌屬Leuconostoc0.0059±0.00110.1002±0.03520.0020普雷沃氏菌屬-7Prevotella-70.0752±0.00352.1454±1.08120.0020羅斯氏菌屬Roseburia0.0299±0.00370.2967±0.13010.0020月形單胞菌屬-4Selenomonas-40.0057±0.00120.0017±0.00030.0020假丁酸弧菌屬Pseudoscardovia0.0001±0.00010.0109±0.00350.0060琥珀酸弧菌屬UCG-001SuccinivibrionaceaeUCG-0010.0150±0.00350.0609±0.01620.0060葡萄球菌屬Staphylococcus0.0049±0.00250.0003±0.00010.0100魏斯氏菌屬Weissella1.9142±0.85167.5733±2.22350.0260未注釋韋榮球菌屬Veillonellaceae-NA0.0010±0.00030.0065±0.00250.0280乳酸乳球菌Lactococcus0.2395±0.08031.2408±0.43650.0340泛菌屬Pantoea0.0499±0.02980.0017±0.00060.0340月形單胞菌屬-1Selenomonas-10.0627±0.02350.0087±0.00140.0340巨球菌屬Megasphaera0.0001±0.00010.0005±0.00030.0391普雷沃氏菌屬-1Prevotella-136.5587±4.956728.2502±2.28740.1399未注釋菌屬NA2.7809±0.21972.4004±0.18740.2198鏈球菌屬Streptococcus2.0133±0.37271.5345±0.29430.3337ChristensenellaceaeR-74.3536±0.60483.4828±0.18390.1898瘤胃球菌屬-2Ruminococcus-23.4513±0.57064.3394±0.81560.3736芽孢桿菌屬Bacillus0.1065±0.06690.0038±0.00070.0220

3 討論

本試驗奶牛瘤胃細菌菌群測序深度超過12 500 reads后，曲線均趨于平緩，各樣品達到飽和狀態，覆蓋率超過99%，測序深度和覆蓋率超過了郭婷婷等[14]和杜琪等[15]，測序結果基本可以反映出奶牛瘤胃細菌區系中的大部分物種。

本試驗中，乳脂在玉米淀粉誘導后期極顯著降低。薛豐[16]研究表明，隨著日糧粗飼料品質提高，細菌、原蟲及纖維降解菌的數量呈上升趨勢。郭鵬等[17]研究表明，當日糧NFC/NDF值由1.02升至1.24(日糧精粗比由50%上升至60%)時，瘤胃細菌總數并未出現明顯的改變；當NFC/NDF值為1.63(精粗比為70%)時，瘤胃細菌總數開始出現顯著增加。本試驗中，飼喂玉米淀粉對瘤胃細菌多樣性和種類分布均勻度均無顯著影響。

在門水平，厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門為奶牛瘤胃優勢菌群，與Sadet-Bourgeteau等[18]和周熊艷等[19]的研究一致。在屬水平，普雷沃氏菌屬、瘤胃球菌屬、梭菌屬、魏斯氏菌屬等是奶牛瘤胃的優勢菌群，其中普雷沃氏菌屬為瘤胃最優勢菌屬，與李子健等[20]和高雨飛等[21]的研究結果一致。

反芻動物瘤胃中的微生物將飼料發酵并轉化為營養成分和能源物質供機體吸收利用。由細菌、真菌、原蟲、古細菌等組成的瘤胃微生物群體成為宿主反芻動物必不可少的共生關系的復雜網絡[22]。奶牛瘤胃中廣泛存在著降解和利用淀粉的普雷沃氏菌屬[23]，在本試驗中，雖然普雷沃氏菌屬-1在誘導乳脂下降后變化不顯著，但是其家族其他菌屬的變化有顯著差異；產酸菌豐度大量增加，醋酸桿菌屬、乳酸桿菌屬、小球菌屬、明串珠菌屬、毛螺旋菌屬-1、瘤胃球菌屬-1、假丁酸弧菌屬、羅斯氏菌屬等豐度極顯著增加；乳酸乳球菌等豐度顯著增加。其中，魏斯氏菌屬[24]、乳酸桿菌屬、乳酸乳球菌、小球菌屬[25]、明串珠菌屬[26]的發酵產物主要是乳酸，醋酸桿菌屬主要發酵產物為乙酸，雷沃氏菌屬發酵產物主要為乙酸、琥珀酸和丙酸[27]，羅斯氏菌屬、假丁酸弧菌屬發酵產物主要為丁酸，瘤胃球菌屬發酵產物主要是乙酸和甲酸，毛螺旋菌屬發酵產物包括甲酸、乳酸、乙酸等。隨著日糧精粗比提高，乳酸桿菌、反芻獸新月單胞菌、埃氏巨型球菌和淀粉分解菌的數量會出現不同程度的增加[28-29]，本試驗結果與前人研究相似。韋榮球菌以乳酸利用為主[14]，本試驗中，未注釋韋榮球菌屬豐度顯著增加，這可能是由于產乳酸菌的增加，使其底物增加，從而增加其豐度。本試驗中，厭氧弧菌屬、腸球菌屬、棲水菌屬、厭氧支原體屬等豐度極顯著降低，芽孢桿菌屬、泛菌屬等豐度顯著降低，這些菌屬大多都是降解葡萄糖，屬于產酸菌，其豐度降低的原因可能是由于這些菌群在瘤胃不是優勢菌群，在與優勢菌群競爭底物時處于劣勢地位，由于競爭性抑制作用，出現了豐度降低的情況。

在淀粉低乳脂日糧誘導的模式下，瘤胃微生物的結構發生改變，其中6個菌門發生顯著變化。試驗共檢測到383個菌屬，90個菌屬差異顯著，大部分豐度有顯著變化的菌群都是產酸菌，玉米淀粉誘導了瘤胃微生物的結構變化，促進了大部分產酸菌群的增殖。但是由于菌群數量很多，部分在瘤胃占菌群總比例較少的菌群沒有一一進行分析，細菌之間的協同作用及數據還有待進一步整理和發掘。