外周血淋巴細胞和CD4+T細胞在類風濕關節炎中的表達和意義

鄭小娟 段亞男 溫鴻雁 李小峰

類風濕關節炎(RA)是一種慢性自身免疫性炎癥性疾病，發生率為0.5%～1.0%，女性和老年人發生率較高[1]。目前病因未明確，認為免疫失衡在其發病機制中具有重要作用。調節性T細胞(Treg)和輔助性T細胞17(Th17)是CD4+T細胞的兩個重要亞群。Th17細胞分泌IL-17，在人類和小鼠中IL-17具有促炎作用，且與許多炎癥相關，而Treg則具有抑制炎癥的作用，并參與了維持自身環境的免疫耐受。本研究采用流式細胞術(FCM)檢測RA患者外周血淋巴細胞及CD4+T細胞亞群的表達情況，并探討其在RA發生、發展中的意義。

對象與方法

1.研究對象:137例RA患者均為2017年5月～2018年8月筆者所在科室住院患者，其中，男性34例，女性103例；患者年齡14～86歲，平均年齡51±13歲；病程0.05～38.00年，平均病程7±8年。其診斷均符合美國風濕學會1987年的RA診斷標準，排除標準：嚴重腎臟、血液系統、心臟、肝臟及內分泌系統疾病患者；消化道疾病患者。要求納入觀察組的患者無干燥綜合征、系統性紅斑狼瘡、結締組織病等免疫疾病或影響免疫的相關疾病。同時收集50例來筆者醫院健康體檢者為健康對照組，其中，男性8例，女性42例；年齡20～66歲，平均年齡42±14歲。病例組和對照組的年齡、性別等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

2.研究方法：采集137例RA患者及50例正常人外周血，并收集它們的所有臨床資料，包括性別、年齡、病程，用流式細胞儀技術(FCM)檢測正常人和患者外周血淋巴細胞亞群絕對數、CD4+T細胞亞群絕對數。山西醫科大學第二臨床醫學院風濕免疫科實驗室為該課題提供數據。

3.主要設備及試劑:采用美國BD公司提供的 FACS Calibur流式細胞儀。淋巴細胞檢測使用試劑：單克隆抗體 CD3/CD8/CD45/CD4；CD3/CD16+56-/CD45/CD19；Trucount 管(內部含有數量可知的Beads)；FACS Lysing Solution(溶血素)(10×，使用前用蒸餾水稀釋成1×)；CD4+T細胞亞群檢測使用試劑：離子霉素、胎牛血清、1640液、高爾基阻斷劑、刺激素PMA購自美國Sigma公司。單克隆抗體CD4-FITC、IL-4-PE、IFN-γ-APC、IL-17-PE、CD25-APC、FoxP3-PE購自美國BD公司。

4.淋巴細胞檢測:兩支Trucount管順序分別編號A和B；將50μl盡量混勻的抗凝全血倒入到Tube中(使用的方法是反向加樣法)；另外再取 CD3FITC/CD8PE/CD45PercP/CD4APC抗體20μl加入到A管中；取 CD3FITC/CD16+56-PE/CD45 PercP/CD19APC抗體20μl加入到B管中。渦旋混勻，室溫避光放置15～20min。將450μl 1×FACS溶血素倒入其中，均勻混合，室溫避光靜置15min。24h內將A、B管放入檢測儀上，在MultiSET軟件上抽取15000個細胞進行檢測。上機前應充分混勻。

5.Th細胞亞型標記:(1)Th1細胞、Th2細胞、Th17細胞培養與標記:在刺激劑10μl PMA工作液(終濃度30ng/ml)、10μl Ionomycin工作液(終濃度750ng/ml)和1μl GolgiStop中分別加入80μl抗凝血，調整CO2培養箱溫度在37℃，并刺激上述試劑5h。將細胞分成A管和B管，將抗人CD4-FITC分別倒入A管和B管，在沒有光照的室溫下培育30min后，將配置不久的Fixation/Permeabilization液1ml分別倒入各管渦旋攪勻，4℃避光孵育30min后，將IL-4-PE和IFN-γ-APC加入A管，將抗人IL-17-PEB倒入B管。(2)Treg細胞標記:將CD4-FITC和CD25-APC分別加入80μl抗凝血，室溫避光孵育30min后，A、B管分別加入新鮮配置的Fixation/Permeabilization液1ml渦旋混勻，4℃避光孵育30min后，加入抗人FOXP3抗體，在沒有光照的室溫下培育30min后，PBS清洗，上機測試。(3)流式細胞儀測定:24h內上流式細胞儀(Calibur, 美國BD公司)，并用流式細胞技術測定分析結果。根據對淋巴細胞設門區分淋巴細胞，該區分采用的是前向角散射光(FSC)及對側向角散色光(SSC)的散點圖，區分Th細胞(CD4+)的方法是通過CD4對SSC設門，選擇門內10000個細胞，以CellQuest軟件取得、分析相應百分數，并推算出絕對數量。

6.統計學方法：數據采用SPSS 20.0統計學軟件對數據進行統計分析；數值變量不服從常態分布，采用中位數(四分位數)法進行統計描述；兩樣本比較采用Mann-WhitneyU檢驗；組間比較采用方差分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.RA與健康人淋巴細胞絕對計數的比較：RA患者Th細胞明顯高于健康對照組、NK細胞明顯低于健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 兩組外周血淋巴細胞絕對數[個/微升，M(P25，P75)]

2.RA患者與健康組CD4+T細胞絕對計數的比較：除Th17細胞外，其Th1、Th2、Treg、Th1/Th2、Th17/Treg與健康對照組比較，差異均有統計學意義(P<0.05)，詳見表2。

3.早期RA與非早期RA淋巴細胞絕對計數的比較：非早期RA患者總T明顯低于早期RA患者，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表3。

4.早期RA與非早期RA患者CD4+T細胞絕對計數的比較：非早期RA患者Th17細胞明顯低于早期RA患者，差異有統計學意義(P<0.05)，詳見表4。

表2 兩組外周血CD4+T細胞絕對計數[個/微升，M(P25，P75)]

表3 兩組外周血淋巴細胞絕對數[個/微升，M(P25，P75)]

表4 兩組外周血CD4+T細胞絕對數[個/微升，M(P25，P75)]

5.外周血CD4+T細胞絕對計數的比較：初治組、復治組與健康對照組CD4+T細胞亞群比較，Th1、Th2、Th1/Th2、Th17/Treg均有統計學意義(P<0.05)，詳見表5。

表5 3組外周血CD4+T細胞絕對數的比較[個/微升，M(P25，P75)]

6.不同疾病活動分層中，Th17、Treg、Th17/Treg細胞絕對數的變化：在低活動組和中活動組中Th17細胞絕對數高于健康對照組，其中3.2

表6 不同疾病活動分層Th17、Treg、Th17/Treg細胞絕對數的變化[個/微升，M(P25，P75)]

討 論

RA是一種慢性自身免疫性疾病,盡管發病機制不明確,但已認識到RA與機體免疫功能相關。研究表明Th/Ts細胞的平衡，在自身免疫性疾病的發生、發展過程中起重要作用。此外NK細胞存在RA患者的滑膜液中，被認為在骨破壞中起重要作用[2]。本研究結果顯示，RA患者Th細胞在外周血淋巴細胞中所占的絕對計數明顯高于正常人，說明Th細胞參與RA疾病的發病。并且NK細胞在外周血中所占的絕對計數明顯低于正常人。究其原因，有研究指出，NK細胞功能與運動之間有一定聯系，包括血運、缺氧和體溫調節對NK細胞功能的影響[3]。由此可知，可能是多種因素導致RA中NK細胞絕對數量及功能降低，進而影響其發揮免疫調節作用，而不完全是RA疾病本身所導致的數量減少。

另有研究表明，CD4+T細胞亞群中Th1、Th2等異常在RA的發生、發展中發揮重要作用[4]。以前多數認為RA是由Th1驅動的疾病，Th1細胞與炎癥有關，而Th2細胞在一定程度上有抗炎作用。有實驗對RA縱向研究發現，在RA早期的PBMCs中，Th2反應占主導地位，而長期慢性RA表現出Th1占主導反應[5]。可知Th1或Th2反應是否在RA中占主導作用可能取決于多種因素，包括患者年齡、RA分期(早期或晚期)以及病情所在位置(PBMCs或滑膜液)。本研究結果發現，RA患者Th1細胞在外周血淋巴細胞所占的絕對計數明顯高于健康對照組，該結果與陳俊偉等[6]的研究結果相近，說明Th1細胞在RA疾病的發病中起到一定的作用。Th2細胞在外周血淋巴細胞所占的絕對計數明顯低于健康對照組，且Th1/Th2在外周血淋巴細胞所占的比例明顯高于健康對照組，兩者比較差異均有統計學意義，提示Th1、Th2與RA發病均有一定的相關性，且Th1/Th2失衡在RA的發病起關鍵作用。

有研究認為Th17來源的細胞因子通過誘導IL-6、GM-CSF、IL-8等來吸引不同類型細胞，尤其是IL-17A和IL -17F是參與RA發病機制的關鍵細胞因子，此外，Th17細胞產生的IL-21促進B細胞分化為產生自身抗體的漿細胞，并以自分泌方式放大Th17細胞反應[7]。

本研究顯示，RA患者Th17細胞計數比健康對照組高，兩者比較差異無統計學意義，與賈瑞環等[8]的研究結果相一致。某種程度上說明Th17細胞在RA中起到的作用有限。Liu等[9]從大鼠淋巴細胞檢測Th17/Treg細胞比例，與對照組比較，大鼠關節炎Treg細胞表達水平明顯下降，IL-17表達水平明顯升高，本研究結果與該研究結果相矛盾。盡管許多研究結果不全相同，但普遍認為Th17細胞某種程度上參與RA疾病進展。也有研究顯示，STAT3 對Th17 細胞分化有著關鍵的作用，上調STAT3促進Th17細胞分化，下調STAT3抑制Th17細胞分化，由此可以通過影響STAT3誘導Th17細胞向有利的方向分解[10, 11]。

與Dong等[12]的研究結果一致，本研究結果也證實了RA患者外周血Treg細胞絕對數比正常人明顯降低，且Th17/Treg比值比健康對照組明顯升高，兩者比較差異均有統計學意義。說明Treg細胞絕對數量減少及功能降低是造成RA發病的關鍵因素，且Th17/Treg平衡紊亂在RA的發展中發揮關鍵作用。在人類中,Th17細胞可以誘導IL-6、IL-1β和TNF-α，所有這些在活動性RA患者發炎的關節中都很多,并直接參與軟骨和骨的破壞[13]。雖然通常認為Th1和Th17細胞在RA的進展中發揮重要作用，Evans等[14]進一步研究報道，體內自發激活了從RA患者炎癥關節中提取的CD14+單核細胞，并特異性誘導Th17，而非Th1或Th2反應。可知，在RA患者中增多的Th17細胞激活同時受體內自身因素影響。

有研究顯示，在體外骨髓源性抑制細胞(MDSCs)抑制小鼠CD4+T細胞IL-17表達，上調FOXP3表達[15]。體內注射MDSCs可明顯改善炎癥性關節炎。經MDSCs處理的小鼠脾臟Th17細胞和Th1細胞減少，Treg增加，提示MDSCs可能是治療自身免疫性疾病的有效策略。通過不同方式調節Th17/Treg失衡將成為糾正免疫穩態的重要途徑。

本研究顯示，非早期RA患者外周血總T細胞絕對數明顯低于早期RA患者，說明非早期RA患者免疫力更低，隨著疾病進展，淋巴細胞在外周血中的絕對數明顯減少，表明非早期RA患者更容易發生感染。而非早期RA患者Th17細胞絕對數明顯低于早期RA患者，差異有統計學意義，其一可能與RA患者長期使用DMARDS藥物治療導致免疫抑制的結果，其二也可能與RA的分期(早期或非早期)以及病情所在的位置(PBMCs或滑膜液)相關聯。同時本研究對59例初治RA患者、78例復治RA患者與50例健康人比較，發現Th17/Treg細胞比值較健康人明顯升高，提示初治患者及使用DMARDS藥物治療的復治患者均存在免疫失調，間接反應出長期使用DMARDS藥物治療不能很好地控制疾病進展。

為尋找更好的治療方案，Jhun等[16]研究顯示，二甲雙胍和輔酶Q10聯合應用減少關節炎癥、Th17分化和IgG生成，誘導Treg分化，降低破骨細胞生成，且二者的結合促進了線粒體O2的消耗，二甲雙胍和輔酶Q10聯合使用可降低CIA的嚴重程度，改善線粒體功能障礙，該研究為類風濕關節炎提供了新的治療策略。此外，本研究將137例RA患者根據疾病活動度進行分層，分為低活動組、中活動組、高活動組，發現隨著疾病活動度的增高，在低活動組和中活動組中Th17細胞絕對數明顯高于健康對照組，同時Th17/Treg在DSA28≤3.2組及3.2

綜上所述，Th17/Treg細胞可能在RA的發病中發揮著重要的作用，但它們之間的相互抑制、相互作用的關系，仍不明確，有待于今后進一步研究。