SAM系小鼠生命進(jìn)程和生存質(zhì)量評價以及壽命分析

樊 蕊 杜 倩 郝云濤 徐美虹 李 勇

隨著生活水平和醫(yī)療保健技術(shù)的不斷提高和完善，人類的平均壽命逐漸延長，中國已邁入了老齡社會。老年人的身心健康和生活質(zhì)量引起了科學(xué)界的高度關(guān)注。為此，如何對衰老進(jìn)行客觀量化的評價，進(jìn)而據(jù)此采取有效的措施延緩衰老，提高生存質(zhì)量，已成為當(dāng)今世界性的重大醫(yī)學(xué)課題。

衰老是人口老齡化面臨的首要問題。衰老是一種正常而復(fù)雜的生物學(xué)過程，是所有生物的共同特征，衰老表現(xiàn)為組織和功能衰退，適應(yīng)性和抵抗力減退。為了充分深入地研究衰老機(jī)制以及延緩衰老的方法，衰老相關(guān)疾病動物模型的研究有著十分重要的價值。目前建立的大鼠、小鼠等嚙齒類動物的衰老模型包括自然衰老模型，D-半乳糖所致衰老模型，去胸腺衰老模型，臭氧損傷衰老模型，SAMP系小鼠衰老模型等，且各模型均有其優(yōu)勢及不足[1～4]。

快速老化小鼠(senescence accelerated mouse, SAM)是日本京都大學(xué)Takeda教授經(jīng)過20多年精心培育得到的一種近交系衰老模型鼠，包括SAMP(senescence accelerated prone mouse, SAMP)和SAMR(senescence accelerated resistant mouse, SAMR)兩種品系[5]。SAMP在進(jìn)入成熟期(約4～6月齡)后迅速出現(xiàn)行動反應(yīng)遲緩、被毛光澤減退、脫毛、皮膚潰瘍、眼周損害、角膜潰瘍、白內(nèi)障、脊柱彎曲等老化特征，SAMR表現(xiàn)為正常衰老，一般作為SAMP的正常對照。SAMP8是SAMP系中的一個亞系，主要以學(xué)習(xí)記憶能力障礙為老化特征，其壽命約為12.1個月，是目前比較理想的自然衰老模型小鼠[6,7]。

目前學(xué)者對于SAMP8小鼠的研究多集中在腦退化方面，而對于其衰老的評價以及老齡小鼠的生存質(zhì)量并未見報道，同時對于該模型小鼠的實(shí)際壽命也未見具體報道[8,9]。在對衰老的研究中，衰老的評價是衰老研究領(lǐng)域中的關(guān)鍵問題和難點(diǎn)問題。本研究對SAM系小鼠喂養(yǎng)終生，對其衰老的進(jìn)程以及生存質(zhì)量予以探析，對于其壽命予以統(tǒng)計，以期對充分恰當(dāng)?shù)膽?yīng)用該模型小鼠提供理論依據(jù)，同時對衰老的評價提供思路和參考。

材料與方法

1.材料：4月齡SPF級雄性SAMP8小鼠20只，相同月齡的SAMR1小鼠25只，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗動物中心提供,實(shí)驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK(京)2016- 0010，屏障環(huán)境動物房,實(shí)驗動物使用許可證號為SYXK(京)2016-0041，單籠單只飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境溫度21～23℃，濕度50%～60%。喂飼普通小鼠生長飼料，所有動物自由飲水進(jìn)食。動物喂養(yǎng)及實(shí)驗嚴(yán)格按照 《北京市實(shí)驗動物管理條例》執(zhí)行，并經(jīng)過北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理學(xué)委員會審核通過 (批準(zhǔn)號: LA2017017)。

2.動物一般狀態(tài)觀察及體格指標(biāo)測定：每周觀測并記錄動物的活動度、毛發(fā)光澤、攝食量、飲水量、體質(zhì)量。

3.臟器指數(shù)：各組小鼠飼養(yǎng)臨近至壽命終點(diǎn)時，小鼠稱重后脫頸椎處死，無菌快速剝離腓腸肌及其他肌肉，記錄腓腸肌質(zhì)量、其他肌肉質(zhì)量。分別稱重小鼠的心臟、肝臟、腎臟、脾臟、胸腺，計算臟器指數(shù)。臟器指數(shù)(g/kg)=臟器重(g)/體質(zhì)量(kg)。

4.爬網(wǎng)實(shí)驗：分別在小鼠16周齡、45周齡和84周齡時，將小鼠放在垂直的金屬網(wǎng)上，金屬網(wǎng)(長度1.5m，寬帶0.5m)置于距地面0.5m處，記錄每只小鼠在金屬網(wǎng)上停留時間。為了表征小鼠的運(yùn)動障礙，根據(jù)爬網(wǎng)實(shí)驗中爬網(wǎng)的時間進(jìn)行轉(zhuǎn)化并進(jìn)行評分，分值賦值如下：當(dāng)爬網(wǎng)時間≤3s，運(yùn)動障礙評分3分；當(dāng)爬網(wǎng)時間3.1～5.0s，運(yùn)動障礙評分2分；當(dāng)爬網(wǎng)時間5.1～7.0s，運(yùn)動障礙評分為1分；當(dāng)爬網(wǎng)時間≥7.1s，運(yùn)動障礙評分為0分。

5.老化度評分：采用日本京都大學(xué)竹田俊男和細(xì)川昌則教授制定的老化度評分標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合小鼠的運(yùn)動能力進(jìn)行適當(dāng)修改，分別將小鼠外在形體及行為的老化改變從外觀衰老(光澤及粗糙程度、脫毛程度)、組織病變(皮膚潰病、眼周損害、白內(nèi)障、陰莖、腫瘤、斷尾)、體態(tài)衰老(脊柱后凸、顫抖)、反應(yīng)退化(反應(yīng)性、被動逃避)及運(yùn)動障礙(爬網(wǎng)能力)13項進(jìn)行綜合評價，再根據(jù)嚴(yán)重程度不同，將每項指標(biāo)標(biāo)定分值，客觀進(jìn)行評分，分值越高則老化度越高。[10]

結(jié) 果

1.SAM小鼠體質(zhì)量變化：隨著SAM小鼠周齡的增加，其體質(zhì)量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，SAMP8小鼠體質(zhì)量的變化大體趨勢與SAMR1小鼠相似，但是在整個生命周期中，整體體質(zhì)量均低于SAMR1小鼠。SAMR1小鼠在30周齡前，其體質(zhì)量呈現(xiàn)增加的趨勢(體質(zhì)量增加期Ⅰ)，在周齡達(dá)到35周后，體質(zhì)量出現(xiàn)小幅度降低后又出現(xiàn)明顯的增加(體質(zhì)量增加期Ⅱ)，SAMR1小鼠在45周齡時，體質(zhì)量達(dá)到最大為41g，45周齡后體質(zhì)量持續(xù)下降(體質(zhì)量下降期Ⅰ)，在55～70周，體質(zhì)量基本恒定(體質(zhì)量恒定期)，當(dāng)體質(zhì)量經(jīng)歷小幅度增加后(體質(zhì)量增加期Ⅲ)，74周后體質(zhì)量急劇下降(體質(zhì)量下降期Ⅱ)。而在SAMR1小鼠體質(zhì)量增加期Ⅰ這段時間，SAMP8小鼠體質(zhì)量反復(fù)變化，且隨著周齡增加，SAMP8并未出現(xiàn)體質(zhì)量恒定期，反而在此期間，SAMP8小鼠體質(zhì)量小幅度降低，詳見圖1。

圖1 SAMR1和SAMP8小鼠生命周期體質(zhì)量的變化

2.SAM小鼠攝食量、飲水量的變化：從整體趨勢看，SAMP8小鼠攝食量高于SAMR1小鼠。SAM小鼠在剛進(jìn)入成熟期(16周)后，進(jìn)食量急劇增加，當(dāng)達(dá)到20周齡后，SAM小鼠進(jìn)食量降低，當(dāng)SAMR1和SAMP8小鼠周齡達(dá)到30周后，其進(jìn)食量又一次急速增加，均在34周達(dá)到其最大進(jìn)食量，分別為52克/周，45.5克/周，隨后其攝食量出現(xiàn)下降，SAMR1小鼠達(dá)到45周后，攝食量出現(xiàn)小幅度增加后極速降低，當(dāng)周齡54周時降至最低攝食量25.7克/周，隨后其攝食量再一次增加至73周，而SAMP8小鼠在34～47周期間，攝食量持續(xù)降低，隨后其攝食量緩慢增加并保持恒定至73周，而在此期間，SAMP8小鼠攝食量高于SAMR1小鼠，當(dāng)SAMR1小鼠周齡高于74周后，其攝食量降低后有小幅度增加，而74周后 SAMP8小鼠攝食量持續(xù)下降。

從整體趨勢看，在48周前，SAMP8小鼠飲水量低于SAMR1，而隨著周齡增加，SAMP8飲水量高于SAMR1。SAM小鼠飲水量變化分為8個時期，依次為：飲水量增加期Ⅰ(SAM小鼠，16～20周齡)；飲水量降低期Ⅰ(SAM小鼠，20～33周齡)；飲水量增加期Ⅱ(SAMR1小鼠，33～44周齡；SAMP8小鼠，33～37周齡)；飲水量降低期Ⅱ (SAMR1小鼠，45～49周齡；SAMP8小鼠，37～49周齡)；飲水量增加期Ⅲ(SAM小鼠，49～53周齡)；飲水量恒定期(SAMP8小鼠，53～65周齡；SAMR1小鼠，53～57周齡)；飲水量降低期 Ⅲ(SAMR1小鼠，57～74周齡； SAMP8小鼠，65～75周齡)，詳見圖2。

圖2 SAMR1和SAMP8小鼠生命周期攝食量、飲水量的變化A.攝食量；B.飲水量

表1 臨近壽命終點(diǎn)SAMR1和SAMP8小鼠臟器指數(shù)

3.SAM小鼠臟器指數(shù)：臨近壽命終點(diǎn)的SAMP8小鼠的心臟指數(shù)、肝臟指數(shù)大于SAMR1小鼠，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而SAMP8小鼠脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和腎臟指數(shù)小于SAMR1小鼠，其中腎臟指數(shù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

4. SAM小鼠骨骼肌含量比較：臨近壽命終點(diǎn)的SAMP8小鼠的腓腸肌和骨骼肌的質(zhì)量均小于SAMR1小鼠，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，成熟期SAMP8小鼠，后肢骨骼肌飽滿，而臨近壽命終點(diǎn)的SAMP8小鼠的后肢肌肉萎縮，并且可以看到脂肪浸潤，與同周齡的SAMR1小鼠的骨骼肌呈現(xiàn)鮮明的對比(圖3)。

5.SAM小鼠衰老評分：老化度評分是從外在形體及行為變化來評定機(jī)體的老化程度，反映了機(jī)體的衰老征象。從圖4中可以看出，14周齡的SAMP8小鼠僅僅表現(xiàn)為脫毛和毛色失去光澤，而在組織病變、體態(tài)衰老、反應(yīng)退化和運(yùn)動障礙方面并無相應(yīng)的表現(xiàn)。而45周齡的SAM小鼠，SAMP8小鼠在外觀衰老、體態(tài)衰老、反應(yīng)退化和運(yùn)動障礙方面得分顯著高于SAMR1小鼠。45周齡的SAMP8和SAMR1小鼠僅在組織病變方面未表現(xiàn)出輕微程度的病變，兩者得分差別微小。臨近壽命終點(diǎn)的SAM小鼠，其運(yùn)動障礙、外觀衰老、體態(tài)衰老和反應(yīng)退化方面的表現(xiàn)顯著差于45周齡SAM小鼠，且與同周齡的SAMR1小鼠比較，SAMP8小鼠在外觀衰老、運(yùn)動障礙以及體態(tài)衰老方面的程度更高。

圖3 SAMR1和SAMP8 臨近壽命終點(diǎn)骨骼肌含量

圖4 SAM小鼠不同時期的衰老評分

6.SAM小鼠壽命分析：由圖5可知，SAMR1小鼠在55～56周齡時，開始出現(xiàn)死亡，此時段死亡比例為5%，但SAMP8小鼠在34～35周齡，便開始出現(xiàn)死亡，此時段死亡比例為7%。在整個生命進(jìn)程中，SAMP8小鼠在40～60周，其生存率急速下降，而SAMR1小鼠在60～67周，73～80周出現(xiàn)兩個死亡率急速上升期。通過分析，SAMR1小鼠中位數(shù)生存時間為79周，飼養(yǎng)52周(1年)，其累計生存比例為1，飼養(yǎng)60周后，其累計生存比例為0.9，而SAMP8小鼠中位數(shù)生存時間為70周，飼養(yǎng)52周(1年)，其累計生存比例為0.73，飼養(yǎng)60周后，其累計生存比例為0.53。通過生存函數(shù)曲線可以看出整體趨勢，即SAMP8較SAMR1小鼠的生存率下降更快，通過LogRank(Mantel-COX,P=0.5)，Breslow(GeneralizedWilcoxon,P<0.05)，通過Tarone-Ware(P<0.05)分析，可知SAMR1小鼠的生存率顯著高于SAMP8小鼠。

圖5 SAM小鼠累積生存函數(shù)圖

討 論

機(jī)體功能下降和紊亂，同時伴隨著生理學(xué)、解剖學(xué)方面的變化和對體內(nèi)外環(huán)境適應(yīng)力和代償力的減退，此綜合現(xiàn)象稱之為衰老。主要表現(xiàn)為機(jī)體學(xué)習(xí)記憶能力下降，臟器功能減退，皮膚彈性下降等。生存質(zhì)量與多方面信息有關(guān)，目前人類健康相關(guān)的生存質(zhì)量評價包括了生理健康、心理狀態(tài)、獨(dú)立能力、社會關(guān)系等方面，對于實(shí)驗動物的生存質(zhì)量研究多集中在疾病狀態(tài)下的生存質(zhì)量，多參考體質(zhì)量、攝食量、腫瘤/疾病惡略程度、腓腸肌質(zhì)量、自主活動能力以及生存期等方面，綜合評價其生存質(zhì)量，對于衰老動物的生存質(zhì)量評價鮮有報道。參考疾病狀態(tài)下實(shí)驗動物的生存質(zhì)量評價，本文提出了綜合體質(zhì)量、攝食量、內(nèi)臟指數(shù)、骨骼肌質(zhì)量、衰老評分以及壽命幾方面，作為參考指標(biāo)綜合評價衰老SAM系小鼠生存質(zhì)量，其中衰老評分體系是在參考日本京都大學(xué)竹田俊男和細(xì)川昌則教授制定的老化度評分標(biāo)準(zhǔn)，并結(jié)合小鼠的運(yùn)動能力進(jìn)行適當(dāng)修改，其可以作為SAMP8小鼠衰老的標(biāo)準(zhǔn)評價指標(biāo)，且具有SAMP8獨(dú)特特征[10]。

動物衰老進(jìn)程中的體質(zhì)量下降是由于構(gòu)成機(jī)體的主要物質(zhì)如蛋白質(zhì)等合成量降低，不足以補(bǔ)充其分解，因此造成結(jié)構(gòu)物質(zhì)不斷損耗，細(xì)胞結(jié)構(gòu)受到破壞。由圖1可知，SAM小鼠體質(zhì)量大體變化趨勢為：在達(dá)到45周齡前，隨著周齡增加，體質(zhì)量基本呈現(xiàn)增加的趨勢，其中SAMR1小鼠體質(zhì)量持續(xù)增加而SAMP8小鼠體質(zhì)量變化較為曲折。當(dāng)SAM小鼠達(dá)到45周齡后，隨著周齡增加體質(zhì)量呈現(xiàn)下降趨勢，SAMP8小鼠體質(zhì)量的變化趨勢與其攝食量變化的趨勢大致相似，尤其是當(dāng)SAMP8小鼠37～41周，其攝食量下降，體質(zhì)量也呈現(xiàn)下降的趨勢。在整個生命周期中，SAMR1小鼠的體質(zhì)量始終高于SAMP8小鼠體質(zhì)量?？梢?，同屬SAMR1小鼠具有正常的衰老特征，其進(jìn)入衰老的時間晚于同屬的SAMP8小鼠。

衰老的因素很多，研究者認(rèn)為免疫系統(tǒng)結(jié)構(gòu)老化與功能下降是衰老的主要原因與標(biāo)志。胸腺是免疫系統(tǒng)的中樞器官，對維持細(xì)胞免疫和調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)起重要的作用。其發(fā)育、退化具有顯著的年齡特征。新生兒的胸腺僅為10～15g，而至青春期可達(dá)30～40g，此后開始退化，到老年期幾乎全部被脂肪組織所替代[11]。因此，在機(jī)體衰老的進(jìn)程中，胸腺功能的衰退最為明顯，因此，胸腺衰老被看作是老化過程中最重要的標(biāo)志之一[12]。研究表明，脾臟的代謝隨年齡增長而減弱，因此，胸腺和脾臟的萎縮，代表機(jī)體免疫功能減弱，可加速衰老進(jìn)程[11]。而腎臟是機(jī)體衰老過程中變化最為顯著的器官之一，可作為表征衰老的指標(biāo)之一。在本實(shí)驗中，SAMP8小鼠胸腺、脾臟指數(shù)均低于SAMR1小鼠，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，提示兩種小鼠胸腺和脾臟萎縮狀況的差異并不明顯。這可能是因為70周齡兩種小鼠均步入衰老時期。而對于D-半乳糖結(jié)合輻射所致昆明小鼠的急性衰老模型中，其胸腺和脾臟指數(shù)顯著降低，這有可能是取材測定時期(20周)并未進(jìn)入昆明小鼠的老年期[13]。本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)SAMP8小鼠腎臟指數(shù)顯著低于SAMR1小鼠(P<0.05)，這表明70周齡的SAMP8衰老程度較SAMR1小鼠更為明顯。

隨著年齡增加，骨骼肌中蛋白質(zhì)合成量不足，細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞后氧化磷酸化功能受損，ATP合成減少，導(dǎo)致體力下降。人體從成熟到衰老，骨骼肌質(zhì)量的下降，肌力減退。到60～70歲，人體肌肉質(zhì)量下降25%～30%，小鼠與大鼠肌肉質(zhì)量下降10%～25%[14]。本實(shí)驗中，與成熟的SAMP8小鼠后肢肌肉比較，70周齡的SAM小鼠后肢肌肉含量降低，并且同周齡的SAM小鼠，SAMP8小鼠肌肉質(zhì)量明顯低于SAMR1小鼠，并且可以清晰的看到，SAMP8小鼠后肢肌肉存在脂肪浸潤的現(xiàn)象。在衰老過程中，肌肉之間脂肪和連接物質(zhì)不斷增多，肌纖維面積萎縮，而收縮物質(zhì)，尤其是2型肌纖維顯著減少，從而導(dǎo)致肌肉體積和重量隨年齡性增加而降低[15]。

本實(shí)驗中還對SAM小鼠的運(yùn)動障礙的程度進(jìn)行了評價，隨著SAMP8小鼠進(jìn)入成熟期，其爬網(wǎng)能力隨著周齡的增加隨之降低，其運(yùn)動障礙程度明顯高于同周齡的SAMR1小鼠。研究發(fā)現(xiàn)，由于在衰老過程中肌肉內(nèi)部性質(zhì)發(fā)生了變化，造成肌肉萎縮，肌肉力量下降，人類從30～80歲，肌肉力量下降30%～40%[16]。84周齡的SAM8小鼠運(yùn)動障礙程度明顯高于同周齡SAMR1小鼠，而成熟期的SAMP8小鼠未見明顯的運(yùn)動障礙，兩者的后肢肌肉含量的差異可由圖4清晰的看到。

本研究發(fā)現(xiàn)45周齡的SAM小鼠，SAMP8小鼠在外觀衰老、體態(tài)衰老、反應(yīng)退化和運(yùn)動障礙的程度顯著高于SAMR1小鼠，表明SAMP8小鼠在經(jīng)過成熟期(4月齡)后進(jìn)入快速衰老而出現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象，其現(xiàn)象與前期報道結(jié)果一致[17]。45周齡的SAM小鼠僅在組織病變方面，兩者未表現(xiàn)出任何組織病變。隨著飼養(yǎng)時間的延長，SAM小鼠衰老程度增加，當(dāng)飼養(yǎng)至84周時，SAPM8小鼠SAPM8表現(xiàn)出明顯的外觀衰老、體態(tài)衰老和運(yùn)動障礙。

有研究報道，SAMP8平均生存期為12～13個月，4～6月齡后開始出現(xiàn)衰老征象，故9月齡已進(jìn)入老化階段[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，SAMP8小鼠在34～35周齡，便開始出現(xiàn)死亡，當(dāng)進(jìn)入 SAMP8小鼠在40～60周之間，其生存率急速下降，對比圖1和圖2，發(fā)現(xiàn)40～60周這段時間，小鼠攝食量和體質(zhì)量也呈現(xiàn)下降的趨勢，此時間段符合文獻(xiàn)中報告的平均生存期限。本研究分析顯示，SAMR1小鼠中位數(shù)生存時間為79周，而SAMP8小鼠中位數(shù)生存時間為70周，可見，本研究報道的SAMP8小鼠的中位數(shù)生存時間長于前期文獻(xiàn)報道[19]。而本研究分析，SAMP8小鼠飼養(yǎng)52周(12個月)，其累計生存比例為0.73，飼養(yǎng)60周后，其累計生存比例為0.53。其最長壽命長于文獻(xiàn)中報道的12～13個月。有研究報道，二甲雙胍對延長SAMP8雄性小鼠的壽命起到積極的作用。通過中劑量組二甲雙胍干預(yù)的SAMP8小鼠12月齡生存率達(dá)到70%，而在本實(shí)驗中發(fā)現(xiàn)，即使不經(jīng)過任何干預(yù)，自然生長的SAMP8小鼠12月齡的生存比例為0.73[20]。與自然衰老的ICR小鼠比較，其飼養(yǎng)26個月，其累計生存比例為0.50[20]。自然衰老的Wistar大鼠半數(shù)生存出現(xiàn)在 92.5周。可見，SAMP8小鼠作為研究衰老的模型鼠。

綜合相關(guān)研究分析，SAMP8小鼠壽命的延長的機(jī)制值得進(jìn)一步研究，并且將在后續(xù)實(shí)驗中開展延長壽命的營養(yǎng)干預(yù)措施研究。