rhEPO減輕糖尿病大鼠尿蛋白排泄機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

劉慧娟 黃 雯 張 梅 陳 燊

糖尿病腎病是主要的糖尿病微血管并發(fā)癥之一，腎小球內(nèi)皮細(xì)胞是腎小球?yàn)V過屏障的重要組成部分，直接受到血液中高濃度血糖、糖基化蛋白終末產(chǎn)物和氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響。腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的損傷產(chǎn)生細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)還影響腎小球足細(xì)胞的生物學(xué)行為，從而影響腎小球?yàn)V過屏障的功能。

內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)是存在于循環(huán)血液中的骨髓來源的細(xì)胞，同時(shí)具有干細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的生物學(xué)標(biāo)志。EPCs的數(shù)量和功能的變化能直接反映內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷。有關(guān)內(nèi)皮祖細(xì)胞的研究顯示，1型和2型糖尿病患者循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的數(shù)量和功能都較正常人有所下降，其數(shù)目和功能的下降與血管內(nèi)皮功能失調(diào)及血管修復(fù)能力下降密切相關(guān)[1]。目前EPCs修復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的研究多以體外培養(yǎng)擴(kuò)增，體內(nèi)移植為基礎(chǔ)，能否通過藥物治療來改善EPC的數(shù)量和功能，成為國內(nèi)外新的研究方向。重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)是一種調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的糖蛋白類激素，主要作用為誘導(dǎo)骨髓原始紅細(xì)胞分化，促進(jìn)外周血紅細(xì)胞生成。近年來，研究發(fā)現(xiàn)促紅細(xì)胞生成素除了治療貧血外，還可以動員骨髓EPCs到外周血中，在血管新生中發(fā)揮重要作用[2～5]。實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了rhEPO在體外可以增強(qiáng)EPCs的活性，其增殖、黏附和遷移功能是與其參與血管新生直接相關(guān)的[6]。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動物:SD大鼠，雄性，鼠齡6～8周，體質(zhì)量170～190g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司(實(shí)驗(yàn)動物許可證號為SKXK京2012-0001)，適應(yīng)性喂養(yǎng)5天后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。試驗(yàn)組(28只)：按60mg/kg一次性腹腔快速注射2%的STZ液。對照組(NC組)7只：按60mg/kg一次性腹腔注射檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖液。在注射STZ后72h采集兩組動物的尾靜脈血，用快速血糖測定儀測定血糖，血糖濃度>16.7mmol/L判定為1型糖尿病動物模型。模型不達(dá)標(biāo)者，3天后以40mg/kg再次腹腔注射2%的STZ液。隨機(jī)將實(shí)驗(yàn)組大鼠分為3組：①糖尿病組(DM組)9只；②應(yīng)用25U/kg的rhEPO治療組(DMTA組)9只；③應(yīng)用50U/kg的rhEPO治療組(DMTB組)10只。每周3次，連用8周。EPO注射8周后處死所有大鼠。

2.實(shí)驗(yàn)儀器:XN-1000全自動血液分析儀 (日本Sysmex公司)；UniCel Dxi 800全自動化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(德國Becman Counter公司)；NovoCyte D206OR 流式細(xì)胞儀(艾森生物杭州有限公司)。

3.實(shí)驗(yàn)試劑：重組人促紅細(xì)胞生成素(rhEPO)(益比奧，沈陽三生制藥公司)；兔抗大鼠VEGFR-2多克隆抗體、小鼠抗大鼠JG12單克隆抗體、PE標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD34多克隆抗體[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]；鏈脲佐菌素(STZ)(北京博愛港經(jīng)貿(mào)中心)。

4.大鼠血壓測量：37℃條件下預(yù)加溫5min后固定尾動脈，使用大鼠智能無創(chuàng)血壓測定系統(tǒng)測定大鼠血壓。每只大鼠重復(fù)測量3次，取平均值。

5.標(biāo)本留取檢測血、尿相關(guān)指標(biāo)：處死前24h將所有大鼠單個(gè)置于代謝籠中。(1)尿液：收集24h尿標(biāo)本，離心后取上清測尿微量白蛋白含量。(2)血液：2%戊巴比妥鈉按40mg/kg腹腔給藥，麻醉后，從腹主動脈取血5ml，其中3ml用來檢測血清尿素氮(BUN)、血肌酐(Scr)、白蛋白(ALB)，另2ml用2%EDTA抗凝，行血常規(guī)及裂解紅細(xì)胞后流式細(xì)胞儀檢測。ELASA法測定尿微量白蛋白(按照說明書操作)。

6.大鼠外周血EPCs的分離、鑒定:(1)CD34/VEGFR-2雙陽性細(xì)胞的標(biāo)記方法(VEGFR-2為間接標(biāo)記):①取100μl血樣至ISO和Test管，加紅細(xì)胞裂解液1ml，震蕩儀震蕩，反應(yīng)8min后離心，棄去上清液。1%BSA-PBS緩沖液洗滌；②加入VEGFR-2抗體(間接標(biāo)記一抗)1μl，混勻，4℃孵化1h。1%BSA-PBS緩沖液洗滌；③加APC標(biāo)記的羊抗兔二抗1μl(10μl二抗+90μl PBS稀釋濃度為0.2μg/μl)，再加PE標(biāo)記的CD34抗體5μl，混勻，4℃避光孵化1h。1%BSA-PBS緩沖液洗滌；④加入1%BSA-PBS緩沖液0.5ml重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測熒光值，每管計(jì)數(shù)50000個(gè)細(xì)胞。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測:經(jīng)流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)時(shí)，首先根據(jù)FSC/SSC設(shè)門，在散點(diǎn)圖中圈選單個(gè)核細(xì)胞區(qū)域，排除雙聯(lián)體細(xì)胞、血小板、細(xì)胞碎片、微顆粒等雜質(zhì)，依據(jù)CD34SSC設(shè)第2個(gè)門，圈定PE-CD34陽性的細(xì)胞群區(qū)域，第3個(gè)門用來選取CD34和VEGFR-2雙陽性細(xì)胞，并在收集50000個(gè)細(xì)胞后停止檢測，計(jì)數(shù)CD34和VEGFR-2雙陽性細(xì)胞。

7.免疫組織化學(xué):①脫蠟、水化組織切片，進(jìn)行抗原熱修復(fù)；②3%H2O2去離子水孵育5～10min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；③滴加JG-12一抗(1∶100)，4℃冰箱過夜；④滴加二抗，室溫孵育40min；⑤0.05% DAB顯色，鏡下控制染色結(jié)果；⑥蒸餾水充分沖洗，蘇木精復(fù)染,梯度乙醇脫水,二甲苯誘明,中性樹膠封片。JG12免疫組化分析：根據(jù)腎小球染色結(jié)果，每張切片隨機(jī)選取10個(gè)腎小球，經(jīng)QUIN軟件劃出腎小球的范圍，顯示腎小球面積，選中腎小球中染色陽性的區(qū)域，顯示染色陽性面積，計(jì)算JG12與腎小球總面積的比值，然后取平均值。

結(jié) 果

1.rhEPO對糖尿病大鼠血Scr、血BUN、血ALB、血紅蛋白、血壓、血糖和腎重量/體質(zhì)量的影響:于皮下注射EPO 8周后，發(fā)現(xiàn)糖尿病組血BUN較對照組明顯升高(P<0.05)，血ALB較對照組明顯降低，應(yīng)用rhEPO治療后血Scr、血ALB水平與糖尿病組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表1)。各組大鼠血壓無變化，糖尿病組血糖和腎重量/體質(zhì)量較對照組明顯升高，應(yīng)用rhEPO后無變化(表2)。

表1 各組大鼠8周血Hb、HCT、BUN、Scr、ALB的變化

表2 各組大鼠8周血糖、腎重量/體質(zhì)量比、血壓的變化

2.rhEPO對糖尿病大鼠24h尿微量白蛋白的影響:rhEPO皮下注射8周后，檢測各組大鼠24h尿微量白蛋白，發(fā)現(xiàn)糖尿病組24h尿微量白蛋白較對照組顯著增高，DMTB組24h尿微量白蛋白較糖尿病組顯著降低，而DMTA組尿微量白蛋白有降低趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表3)。

表3 各組大鼠8周24hUAlb的變化

3．rhEPO對糖尿病大鼠腎臟Aminopeptidase P(JG-12)表達(dá)的影響:DM組腎小球JG12表達(dá)均較對照組顯著減少(P<0.05)，應(yīng)用rhEPO治療后，JG-12表達(dá)增加，大劑量組增加更為明顯(P<0.05,圖1、圖2)。

圖1 JG12免疫組化染色(×400)A.NC組；B.DM組；C.DMTA組；D.DMTB組

圖2 腎小球毛細(xì)血管JG-12的表達(dá)與NC組比較，*P<0.05；與DM組比較，#P<0.05

4.rhEPO對糖尿病大鼠外周血EPCs的影響:應(yīng)用rhEPO治療糖尿病大鼠后，其外周血中EPCs的數(shù)量有增加趨勢，呈劑量依賴性，DMTB組EPCs數(shù)量增加更為明顯，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3、圖4)。

圖4 外周血EPCs的數(shù)目

討 論

糖尿病腎病(DN)臨床表現(xiàn)為蛋白尿、漸進(jìn)性腎功能損害或晚期出現(xiàn)嚴(yán)重腎衰竭，是患者的主要死亡原因之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病大鼠24h尿微量白蛋白排泄明顯升高，較高劑量rhEPO治療組與糖尿病組比較，尿微量白蛋白顯著下降。較低劑量的rhEPO治療組尿微量白蛋白排泄亦有下降趨勢。

在糖尿病腎病進(jìn)展的患者中，腎小球毛細(xì)血管的減少是腎小球?yàn)V過率下降的關(guān)鍵事件，伴隨著微血管的塌陷，缺氧的環(huán)境提供了纖維化的潛在刺激，導(dǎo)致以腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化為特點(diǎn)的晚期糖尿病腎病[7]。JG-12是毛細(xì)血管的特異性標(biāo)志物。在本研究中，選取JG-12作為腎小球內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)志物檢測各組大鼠微血管內(nèi)皮的損傷和修復(fù)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，糖尿病大鼠腎小球JG-12表達(dá)明顯減少，說明在STZ糖尿病大鼠出現(xiàn)的腎臟微血管病變以腎小球微血管內(nèi)皮損傷和毛細(xì)血管的萎縮、減少為特征性表現(xiàn)，與以往的研究結(jié)果一致[8]。內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量減少、功能受損、毛細(xì)血管萎縮、丟失等微血管病變導(dǎo)致腎組織慢性缺血、缺氧和營養(yǎng)供應(yīng)缺乏。內(nèi)皮是接觸血液的首個(gè)屏障，血管內(nèi)皮細(xì)胞一旦出現(xiàn)損傷，其合成和釋放多種血管活性物質(zhì)(如NO)和細(xì)胞因子(如血管內(nèi)皮生長因子VEGF)之間的平衡被打亂，引起功能障礙，可累及人體多個(gè)臟器。

結(jié)合前期的研究，筆者認(rèn)為內(nèi)皮細(xì)胞的損傷直接影響其旁分泌細(xì)胞因子和血管活性物質(zhì)，以及與腎小球系膜細(xì)胞、足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞、腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞的信號交流，內(nèi)皮細(xì)胞本身的表型亦發(fā)生改變，致使組織損傷和保護(hù)因素之間的平衡被打破，是腎臟進(jìn)一步損傷的基礎(chǔ)[9～11]。STZ大鼠的微量白蛋白尿排泄增加和內(nèi)生肌酐清除率的上升與此有關(guān)。此時(shí)，內(nèi)皮損傷若不及時(shí)修復(fù)將會導(dǎo)致病變加重直至腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化。

在內(nèi)皮損傷的修復(fù)方面，多項(xiàng)研究認(rèn)為，骨髓來源的、存在于循環(huán)中的具有血管生成潛能的細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)是主要的修復(fù)方式[12，13]。內(nèi)皮祖細(xì)胞即是具備內(nèi)皮生成潛質(zhì)的細(xì)胞，它可以增殖、分化并移行至損傷部位成為內(nèi)皮細(xì)胞，執(zhí)行其功能[14～16]。目前，相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究主要是將骨髓或外周血中的內(nèi)皮祖細(xì)胞收集，體外培養(yǎng)，增殖至一定的數(shù)量回輸[17，18]。實(shí)驗(yàn)在體外進(jìn)行，耗時(shí)長，治療間斷進(jìn)行，回輸?shù)募?xì)胞在體外培養(yǎng)有表型轉(zhuǎn)變的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究嘗試尋找促使體內(nèi)內(nèi)皮祖細(xì)胞補(bǔ)充的方法。

促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin，EPO)是最早發(fā)現(xiàn)并應(yīng)用于臨床的造血因子之一，除了具有治療貧血、抗炎、抗氧化應(yīng)激等作用外，還可以刺激內(nèi)皮祖細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮恢復(fù)，在組織局部缺血部位參與新生血管的形成。本研究中，應(yīng)用EPO治療的大鼠，尿微量白蛋白明顯下降，腎小球JG-12表達(dá)明顯增加，提示腎小球微血管內(nèi)皮損傷得到了一定程度的修復(fù)。同時(shí)，rhEPO治療的糖尿病大鼠，尿微量白蛋白排泄較糖尿病組大鼠減少，并呈劑量依賴，提示腎臟結(jié)構(gòu)及功能得到改善，與微血管內(nèi)皮損傷的修復(fù)有關(guān)。大鼠應(yīng)用EPO皮下注射8周后，發(fā)現(xiàn)外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量有升高趨勢，且與劑量呈正相關(guān)，這與報(bào)道相一致[8]。在本研究中，糖尿病大鼠經(jīng)rhEPO干預(yù)后，毛細(xì)血管的標(biāo)志JG-12的變化與循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞的變化趨勢一致，筆者推測內(nèi)皮祖細(xì)胞可能直接參與了內(nèi)皮損傷的修復(fù)。但外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞只有升高趨勢，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其可能的原因?yàn)镋PO促進(jìn)EPCs增加，這與高血糖所致的EPCs減少尚未達(dá)到一定的平衡有關(guān)，模型時(shí)間只有8周，或還不足以引起外周血中EPCs的明顯差異，可能通過延長實(shí)驗(yàn)時(shí)間或調(diào)整劑量明確EPCs的變化，這有待于進(jìn)一步研究。

近年來研究發(fā)現(xiàn)刺激EPCs的骨髓動員，可使其遷移到損傷組織，分化成內(nèi)皮細(xì)胞并形成新生的血管，EPCs不僅參與胚胎血管生成，也參與出生后的血管新生過程。新生血管中25%的內(nèi)皮細(xì)胞是由EPC分化而來的[19，20]。EPC通過自身的分化、增殖而形成的新生血管不受原有血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的影響，且受損的內(nèi)皮層可由循環(huán)EPC重生，EPC可促進(jìn)重新內(nèi)皮化。有研究表明，糖尿病患者的內(nèi)皮祖細(xì)胞除了數(shù)量下降，其遷移和歸巢功能也有一定程度的減弱[18]。本研究僅就EPO對糖尿病大鼠循環(huán)內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量的變化與腎臟結(jié)構(gòu)功能的變化的關(guān)系進(jìn)行了探討，但EPO可能對內(nèi)皮祖細(xì)胞的內(nèi)皮修復(fù)作用在遷移、歸巢、分化等不同的環(huán)節(jié)有更多的作用，需要實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。